目的在小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)的基础上,分离淋巴管内皮祖细胞(LEPCs),并引入外源性血管内皮生长因子-C(VEGF-C)进行干预,完善小鼠淋巴内皮祖细胞(LEPCs)体外分离、培养及诱导分化的实验方法。方法1、研究以C57BL/6小鼠为对象,通过改良差时贴壁法收集48小时内未贴壁的细胞,并使用EGM-2MV培养基培养至第三代,从而分离纯化骨髓细胞中的内皮祖细胞(EPCs)。2、使用流式细胞仪检测第三代细胞表面标记物CD34、CD133、VEGFR-3,并分析VEGFR-3+CD34+细胞和VEGFR-3+CD133+细胞在EPCs中所占的百分比。3、通过流式细胞术分选出表面标记物血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)阳性的细胞,并使用免疫荧光化学法鉴定其表面CD34、CD133的分布及表达情况。4、将流式细胞仪分选出的LEPCs培养至第3代,用MTT比色法检测LEPCs增殖能力。5、引入外源性血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对LEPCs进行诱导分化,光镜下观察LEPCs形态变化,诱导分化28天后通过免疫荧光化学法检测淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)表达情况。6、用50ng/ml、100ng/ml及150ng/ml三组不同浓度VEGF-C对LEPCs进行诱导分化,通过免疫荧光化学法检测LYVE-1在三组中的表达情况。结果1、流式细胞仪检测结果VEGFR-3+CD34+细胞占EPCs细胞的0.67%,VEGFR-3+CD133+细胞占EPCs细胞的1.52%。免疫荧光化学法检测显示流式细胞仪分选出VEGFR-3+细胞的细胞膜上同时表达CD34及CD133,即分选的细胞为LEPCs。2、LEPCs体外增殖能力较强,前3天细胞数量无明显变化,第4天开始进入对数生长期,第11天后进入平台期,生长曲线呈现“S”形。3、LEPCs经过VEGF-C诱导分化用免疫荧光化学法检测其表面表达淋巴管内皮特殊标记物LYVE-1。4、浓度为100ng/ml的VEGF-C是体外诱导分化小鼠骨髓LEPCs的理想浓度结论通过差时贴壁法和流式细胞仪可从小鼠骨髓中分离提纯LEPCs,EGM-2MV培养基可扩增LEPCs,VEGF-C可诱导LEPCs向淋巴管内皮细胞分化。