研究背景与目的供心再灌注损伤的减轻与避免是心脏移植成功的重要条件。若能有效改善供心的功能，这无疑对救治需心脏移植的终末期心脏病患者具有极为重要的意义。20世纪80年代中期，Murry等人首次提出心肌在经受多次短暂缺血再灌注后能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌损伤，即缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）的心肌保护作用。然而缺血预处理须在心肌缺血前进行施与，对于心脏移植而言，这成为缺血预处理应用于临床的最大障碍。2003年Zhao等人首次提出了缺血后处理（ischemic postconditioning）的概念，在缺血期后的再灌注早期，进行短暂的、间歇性的缺血和再灌注，即缺血后处理，确实可以产生和缺血预处理相类似的明显的对抗心脏缺血／再灌注损伤的保护作用。与缺血预处理相比，缺血后处理方式最大的优点在于保护性的多次短暂缺血／再灌注是施加于缺血发生之后。线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoK_ATP)是一组将心肌代谢与细胞膜电活动耦联的重要通道，近年来，mitoK_ATP通道的激活在心肌保护中的作用越来越引人注目，大量研究显示mitoK_ATP通道开放剂二氮嗪（diazoxide，DE）预处理可模拟缺血预处理效应，缩小心肌梗死面积、减轻再灌注损伤、促进再灌后心功能的恢复、对缺血心肌具有重要的保护作用；DE的心肌保护效应能被特异性mitoK_ATP通道阻断剂5-羟基葵酸盐（5-hydroxydecanoate，5-HD）取消。并且有研究表明，直接在心麻痹液中添加30μM的DE，对长时程冷保存的离体心脏有显著的心肌保护作用。基于以上研究背景，我们推测，缺血后处理或在再灌注初始给予DE可能对长时程冷保存后再灌注的心脏亦有相似的保护作用。因此，本研究利用Langendorff恒压灌注装置构建离体大鼠心脏冷保存／再灌注模型，在再灌注初始即给予缺血后处理或mitoK_ATP通道开放剂DE（30μM），观察缺血后处理对不同冷保存时间（3h和8h）的离体大鼠心脏的影响。重点在于阐明缺血后处理对冷保存心脏的影响，以及与冷保存后／再灌注早期激活mitoK_ATP通道的联系。方法1．心脏泠保存模型的构建离体大鼠心脏于Langendorff恒压灌注装置上平衡30min后，经主动脉根部灌注4℃的Celsior心麻痹液，灌注时间控制在3min以内，心脏表面同时降温，待心脏停跳后分别置于不同成分的心麻痹液中（4℃）保存，3h或8h后心脏被重新置于Langendorff装置上再灌注60min。灌注条件同保存前保持一致。通过MedLab生物信号采集处理系统观察心脏血流动力学的改变，包括：左心室舒张末期压力（LVEDP）、左心室发展压力（LVDP）、冠脉流量（CF）、心率（HR）、心率与发展压的乘积（RPP）、左心室内压最大上升和下降速率(±dP／dt_max)等。2．冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）的检测在再灌注5min、10min、20min收集冠脉流出液，利用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶（LDH）的含量。3．心律失常严重程度的评定各组心脏再灌注时，将两根心电电极分别放置于肺动脉圆锥及心尖部引出心电图（ECG），通过MedLab生物信号采集处理系统记录ECG。根据记录到的ECG，采用Curtis和Walker（1988）心律失常评分法对心律失常严重程度进行定量分析。4．心肌含水量的检测再灌注60min后，留取左心室前壁的一块心肌，用滤纸拭于，称取湿重后置于80℃烘箱中烘烤48h，称心肌干重。心肌水含量=（湿重-干重）／湿重×100％。5．心肌细胞活性的测定用MTT染色，在550nm处测心肌组织formazan的含量。6．透射电子显微镜观察心肌超微结构的改变实验结束后，留取左心室壁上的一块心肌组织，置入2.5％的戊二醛溶液中，制备电镜标本，用透射电子显微镜观察心肌超微结构的改变。7．SABC免疫组织化学法检测心肌细胞Fas和Fas配体（FasL）蛋白的表达实验结束时，切取左室心尖部全层心肌，10％甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。根据Fas／FasL免疫组化试剂盒说明书，采用SABC法检测心肌细胞上Fas和FasL蛋白表达情况。在高倍镜下检测，每张切片随机选择10个视野，总计数1000个细胞左右，胞膜及胞质呈棕黄色为Fas或FasL蛋白阳性表达的细胞，胞膜及胞质透明不着色为蛋白阴性表达的细胞，计算阳性表达细胞占总细胞数的百分比即为Fas或FasL蛋白阳性染色指数。8．测定线粒体渗透性转换孔道开放情况提取心肌细胞线粒体，给予200μmol／L CaCl₂作用于线粒体，连续观察520nm处吸光度的变化以反映线粒体渗透性转换孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放情况。9．实验分组第一部分实验（观察缺血后处理对3h冷保存大鼠心脏的作用）。SD大鼠随机分为3组（n=8）：（1）3h对照组：离体心脏平衡后保存于Celsior心麻痹液中3h，再灌注1h。（2）3h缺血后处理组：离体心脏平衡后保存于Celsior心麻痹液中3h，再灌注1h，并在再灌注即刻给予短暂缺血后处理（再灌注30s+缺血30s，循环3次）。（3）3h缺血后处理+5-HD组：在缺血后处理中，缺血后处理的再灌注30s时给予100μmol／L的5-HD，其他同第2组。第二部分实验（观察缺血后处理对8h冷保存大鼠心脏的作用及其可能的作用机制）。SD大鼠随机分为5组（n=8）：（1）8h对照组：离体心脏平衡后保存于Celsior心麻痹液中8h，再灌注1h。（2）8h二氮嗪组：再灌注即刻给予30μmol／L的DE，灌注3min，其他同第1组。（3）8h二氮嗪+5HD组：再灌注即刻给予30μmol／L的DE和100μmol／L的5-HD，其他同第1组。（4）8h缺血后处理组：在再灌注即刻给予短暂缺血后处理（再灌注30s+缺血30s，循环3次），其他同第1组。（5）8h缺血后处理+5-HD组：在缺血后处理的再灌注30s给予100μmol／L的5-HD，其他同第4组。结果一、缺血后处理对3h冷保存心脏的保护作用1、心脏冷保存3h后，再灌注早期给予缺血后处理（再灌注30s+缺血30s，循环3次），可改善再灌注心脏收缩及舒张功能的恢复，冠脉流量的恢复、降低再灌注10-20min时心律失常的严重程度等。2、缺血后处理对冷保存3h心脏的保护作用可被mitoK_ATP通道特异性阻断剂5-HD所取消。二、缺血后处理和DE对8h冷保存心脏的保护作用1、在再灌注初始即给予缺血后处理或mitoK_ATP通道开放剂DE（30μM），均可明显改善冷保存8h后／再灌注心脏的收缩及舒张功能的恢复，冠脉流量的恢复、减少心肌酶的漏出及心肌水肿程度，降低再灌注10-20min时心律失常的严重程度，提高心肌细胞的活性等。2、缺血后处理对冷保存8h后／再灌注心脏的保护作用与DE心脏保护作用相似，且均可被mitoK_ATP通道特异性阻断剂5-HD所取消。3、200μmol／L的CaCl₂作用于对照组（8h冷保存心脏）心肌线粒体，可引起520nm处线粒体吸光度下降。与对照组相比，在再灌注初始即给予缺血后处理或DE可明显抑制CaCl₂引起的心肌线粒体吸光度下降，提示mPTP的开放减少。而5-HD可取消DE和缺血后处理减轻CaCl₂引起的心肌组织线粒体520nm处吸光度下降的作用（P＜0.05）。4、冷保存8h后，心肌细胞Fas和FasL蛋白表达增加；与对照组相比较，DE组和缺血后处理组明显降低冷保存8h心肌细胞的Fas和FasL蛋白阳性染色指数（P＜0.01）；而5-HD可取消以上的作用。结论缺血后处理可明显减轻长时间冷保存后供心的再灌注损伤，其心肌保护作用是通过激活mitoK_ATP通道来完成的；冷保存后激活mitoK_ATP通道引发心肌保护的机制可能涉及心肌细胞线粒体结构的稳定维持、对心肌细胞促凋亡蛋白的抑制和对mPTP开放的抑制。