【摘 要】
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目的:分离、纯化、培养胃癌原代细胞,探索非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂肼曲嗪（Hydralazine）对胃癌原代细胞p16基因表达及其生物学特性的影响。方法:利用胰酶消化法、无血清培养基培养、差速贴壁法培养纯化胃癌原代细胞,细胞免疫化学法鉴定胃癌原代细胞,细胞毒性试验（cell counting kit-8,cck8）明确肼曲嗪对胃癌细胞的增殖抑制效率,根据不同浓度肼曲嗪对胃癌原代细胞的平均抑制率
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目的:分离、纯化、培养胃癌原代细胞,探索非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂肼曲嗪（Hydralazine）对胃癌原代细胞p16基因表达及其生物学特性的影响。方法:利用胰酶消化法、无血清培养基培养、差速贴壁法培养纯化胃癌原代细胞,细胞免疫化学法鉴定胃癌原代细胞,细胞毒性试验（cell counting kit-8,cck8）明确肼曲嗪对胃癌细胞的增殖抑制效率,根据不同浓度肼曲嗪对胃癌原代细胞的平均抑制率计算半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）,利用细胞划痕试验来评估肼曲嗪对胃癌原代细胞迁移能力的影响,Real Time-PCR、Western Blot法验证肼曲嗪对胃癌p16基因m RNA、蛋白质表达的影响。结果:1、成功分离培养人胃癌原代细胞3例,病理报告显示中分化腺癌为两例,低分化腺癌为一例。胃癌原代细胞形态多样,光镜下显示为圆形,多边形,短梭形,大小不等。细胞免疫化学法检测胃癌细胞癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）、增殖标志物ki-67、广谱角质蛋白（Broad-spectrum Keratin,AE1/3）均呈阳性表达。2、设置cck8加药浓度为0、3、10、30、100、300unol/l,每组5个复孔,继续孵育48小时,每孔加入10ulcck8试剂,根据酶标仪测定的OD值,计算各浓度组抑制率,我们可以得出IC50=227.9u M,根据IC50,我们设置后续试验肼曲嗪浓度梯度为0、50、100、200u M。3、根据上述IC50,设置浓度梯度进行后续试验,细胞划痕试验显示肼曲嗪对胃癌细胞的迁移能力起抑制作用,而Real Time-PCR、Western Blot结果显示P16基因m RNA、蛋白质表达增加。结论:肼曲嗪通过去甲基化使p16基因表达增加,并以此抑制胃癌原代细胞的增殖、迁移。
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