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目的克隆、构建携带编码小鼠全长膜型klotho(mKL)cDNA的腺相关病毒载体(rAAV.mKL);并利用rAAV.mKL转染去势骨质疏松大鼠,观察KL对去势骨质疏松大鼠骨代谢及骨微细结构的影响,揭示KL在骨质疏松骨代谢中的调控机制。方法(1)从小鼠肾脏组织中提取总RNA,RT-PCR扩增小鼠全长mKL蛋白基因片段,将其克隆到pAAV-HnGFP质粒上,构建重组质粒pAAV-mKL,将其转染COS-7真核表达细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达、RT-PCR和免疫荧光检测KL在COS-7中的表达,三质粒共转染的方法将重组质粒转入AAV-293细胞,包装rAAV.mKL;(2)rAAV.mKL转染去势骨质疏松大鼠,观察KL表达对骨质疏松大鼠骨代谢及骨微细结构的影响。将SD雌性大鼠随机分为假手术组(S组)和手术组,外科去势术后12周再随机分为模型组(O组)、17β-雌二醇组(E组)、KL基因组(KO组)和空质粒组(GO组),实验12周后处死。ELISA法检测血浆KL、骨钙素、雌激素表达水平;双能X线检测股骨、胫骨骨密度;冰冻切片及免疫组化法观察肾KL荧光及KL蛋白表达;RT-PCR和免疫组化法检测骨Runx2、MMP-13mRNA及蛋白表达;HE染色观察骨组织形态学变化;透射电镜观察骨细胞形态结构变化。结果(1)通过RT-PCR获得全长小鼠mKLcDNA片段,成功构建重组质粒pAAV.mKL,验证了其在COS-7细胞中高表达,三质粒共转染AAV-293细胞,包装出rAAV.mKL,提取病毒DNA,PCR验证rAAV.mKL携带有小鼠KLcDNA片段;(2)rAAV.mKL转染可减缓去势大鼠骨质疏松症的发展并改善骨微细结构的破坏。O组KL、骨钙素、雌激素血浆表达明显受到抑制,KO组KL、骨钙素水平明显升高;KO组和E组骨密度高于O组和GO组(P<0.05);KO组大鼠肾有小鼠KL基因特异性表达;与O组相比,KO组Runx2mRNA表达明显上调,MMP-13mRNA表达显著下调(P<0.05);免疫组化分析KO组Runx2吸光度值显著高于O组(P<0.05);KO组MMP-13吸光度值显著低于O组(P<0.05)。HE显示KO组、E组和S组大鼠骨小梁排列紧密,连接成网,形态结构较完整,明显优于O组和GO组。透射电镜显示O组、GO组骨细胞内出现髓样结构,而KO组、S组均未发现。结论(1)成功构建携带全长mKLcDNA腺相关病毒载体,将其转染COS-7细胞后可明显上调KL的表达;(2)rAAV.mKL转染去势骨质疏松症大鼠可减缓去势大鼠骨质疏松症的发展及骨组织微细结构的破坏,KL可能在骨质疏松症发展中扮演重要角色。