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目的；肿瘤特异性启动子Survivin调控shRNA真核表达载体腺病毒的构建以及对HepG-2细胞中CD133基因表达的抑制作用。方法；1、pEntry-SUR-GFP-shRNA真核表达载体的构建；参考试剂盒说明书提取HepG-2细胞基因组DNA。根据GenBank(-222to+39, GeneBank Accession NumberAY795969)提供的survivin启动子基因序列及pEntry载体上的酶切位点设sall和NdeⅠ酶切位点(上下游引物序列)5-GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC-3,下游引物序列5-GGAATTCCATATGGAATTCC-3扩增片段为270BP将survivin启动子克隆到pEntry-EF1-GFP-shRNA上,以替换EF1启动子,构建pEntry-Surp-GFP-shRNA真核表达载体。2、pEntry-Surp-GFP-shRNA转染Hela.HepG-2293T细胞株；RT-PCR检测GFP证实GFP的表达由survivin驱动,反应引物上序列为5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3,下游引物序列为5-TTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTG-3,长度200bp,通过转染细胞的荧光强弱,证实survivin在HepG-2。Hela细胞株中有荧光,而293T细胞株中没有荧光,且HepG-2细胞株表达高于Hela细胞,说明survivin基因具有肿瘤特异性。3、shRNA CD133的设计,合成以及Ad.surp-GFP-shRNA的构建和包装：根据GenBank中CD133的核苷酸序列,参考Ambion公司设计shRNA的设原则,(1)设计3条干扰序GCTCAGAACTTCATCACAAAC2377),AAGCCAGAAACTGTAATCT TAG(485), ATGAGATTAAGTCCATGGCAAC(972),(2)通过Blast检索确定三个干扰片段与人类的其他基因不同源；shRNA的合成；将三个干扰片段切成六个小的片段,送华大基因公司合成12条Oligo片段。紫外线分光光度计在260nm波长下定量,(3)切除pEntry-Surp-GFP-shRNA中的shRNA;连接目的基因；通过T4连接酶的作用,将合成好的shRNA927, shRNA485, shRNA2377分别连接到pEntry-Surp-GFP载体上。将构建好的pEntry-Surp-GFP-shRNA通过gateway试剂盒重组腺病毒质粒Ad.Surp-GFP-shRNA,产物转化TOP10感受态细菌,卡那霉素,LB平板,每个板挑选三个阳性克隆摇菌过夜培养。提取质粒,Pac I酶切鉴定重组pAd-Surp-shRNA构建成功,提取质粒测量质粒浓度为A260/A280=1.8032; A260/A280=1.8230;A260/A280=1.7104如图1.1所示,送公司测序,结果正确。Pac Ⅰ酶切后鉴定,重组子酶切显示两条切割带分子量大小与酶切大小符合。通过gateway重组阳性的pAd.surp-GFP-shRNA972, pAd.surp-GFP-shRNA485, pAd.surp-GFP-shRNA2377质粒在293A细胞中包装Ad.Surp-GFP-shRNA, Ad.surp-GFP-shRNA转染到293A细胞,8d收集细胞,离心,2ml灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)重悬,反复冻融,离心收集上清液,此为低滴度的病毒原液Ad.Surp-shRNA,取50%病毒原液反复感染293A,13000rpm离心收集上清,通过流式计算可得到高滴度腺病毒通过公式计算为7.01×10^10TU/ml。4、含Survivin启动子重组的shRNA CD133基因重组的腺病毒对肝癌细胞株HepG-2体外作用的实验研究；含Survivin启动子的条件复制腺病毒Ad.surp-GFP-shRNA972,2377,485转染肝癌细胞株HepG-2感染293T细胞作为对比,应用RT-PCR和Western blot检测CD133mRNA和蛋白的表达；MTT法和Transwell法检测细胞体外增殖和侵袭能力,结果显示,腺病毒972,2377,485能成功封闭CD133蛋白水平的表达；972,2377组能成功敲低CD133mRNA的表达；MTT, Transwell检测证实,实验组细胞生长抑制和侵袭力都低于空白组,计算实验组与空白组相比mRNA抑制率分别为(63.44±0.02)%,(56.98±0.03)%；972组,2377组,485组蛋白抑制率分别为(55.43±0.4)%,(48.65±0.2)%,(34.67±0.4)%；实验组细胞的增殖和侵袭能力也受到显著抑制；972组抑制率为(72.88±0.74)%,2377组抑制率为(59.9±0.87)%,485组抑制率为(30.18±0.95)%。结论：肿瘤特异性启动子survivin调控腺病毒介导的shRNA能显著下调CD133基因的表达,抑制肝癌细胞株HepG-2的增值和减弱其侵袭力CD133的抑制有降低肝癌细胞癌性的作用。结果：肿瘤特异性启动子Survivin调控腺病毒介导的shRNA能显著下调CD133基因的表达,抑制肝癌细胞株HepG-2的增值和减弱其侵袭力。