论文部分内容阅读
为了适应地球自转和公转带来的日夜和四季节律变化,植物控制节律的生物钟基因在应对自然环境变化维持其健康生长发育,发挥重要的作用。生物钟基因通过负反馈调节机制精密调控植物环境适应性,PRRs家族基因是生物钟核心振荡器的主要组分,在植物光周期控制开花途径中发挥重要调控作用,同时影响抗逆性和产量,但其作用尚不够清晰。本研究利用CRISPER/Cas9技术产生的OsPRR家族基因（OsPRR1、OsPRR37、OsPRR73、OsPRR59、OsPRR95）功能缺失突变体,进行耐旱性和主要农艺性状的鉴定,发现OsPRR37在水稻耐旱性上发挥重要作用;以保持系沪旱2B为改良对象对该基因进一步进行了多靶点的基因编辑操作,筛选到生育期和产量发生明显改善的突变体株系,具体主要研究结果如下:1、利用已有的CRISPER/Cas9技术产生的OsPRR1、OsPRR37、OsPRR73、OsPRR59、OsPRR95功能缺失突变体植株,对靶位点进行PCR片段测序,发现每个基因至少产生一种以上的碱基插入或缺失突变体。对这些突变体进行了萌发期PEG6000（20%）、甘露醇（150m M）、ABA（3μM/L）和IAA（1mg/ml）处理、在苗期进行了PEG6000（20%）、小桶土壤干旱胁迫和150m M Na Cl模拟胁迫处理,以及成株期叶片失水速率、衰老速率和农艺性状调查等试验,发现这5个基因在各种处理之间存在明显差异。2、基因OsPRR1正向调控水稻的耐旱性,并影响穗部发育、控制分蘖数量。突变体osprr1的种子在PEG6000（20%）胁迫下,萌发率远低于对照,苗期存活率显著降低,并且鲜重和干重也显著减少。在田间正常条件下,osprr1穗长与对照相似,但一次枝梗数和二次枝梗数显著减少,并且株高变矮、分蘖增加。3、基因OsPRR59在萌发期和苗期均不响应水稻干旱胁迫和盐胁迫,但控制水稻的株高。突变体osprr59在萌发期和苗期的耐旱性和耐盐性与对照无显著差异。在田间正常条件下,osprr59的株高极显著低于对照。4、基因OsPRR95调控水稻的株高和分蘖数,在萌发期通过介导ABA的信号转导途径调控水稻的耐旱性、在苗期正向调控水稻的耐旱性和耐盐性。在萌发期对osprr95进行150m M甘露醇处理,突变体芽长显著高于对照而根长显著低于对照;用3μM/L ABA处理,其根长和芽长则与对照无明显差异。苗期进行PEG6000（20%）和150m M Na Cl胁迫,幼苗期存活率、鲜重和干重均显著低于对照。在正常田间条件下,株高和分蘖数都显著低于对照。5、基因OsPRR73正调控水稻的耐旱性和耐盐性。在PEG6000（20%）胁迫下,osprr73的种子萌发率显著低于对照,苗期存活率、鲜重和干重也显著低于对照。在150m M Na Cl胁迫下,osprr73萌发期的根长和芽长与对照无显著差异,但幼苗的存活率、鲜重以及干重均显著低于对照。在正常田间条件下,osprr73的株高显著低于对照。6、基因OsPRR37苗期正调控水稻的耐旱性,适当的盐浓度会促进osprr37萌发期根和芽的生长。在PEG6000（20%）胁迫下,osprr37种子相对萌发率显著低于对照,苗期存活率、鲜重和干重均显著低于对照。在150m M Na Cl胁迫下,萌发期的根长和芽长均显著高于对照。在150m M甘露醇和3μM/L ABA处理下,均表现为芽长显著低于对照、根长显著高于对照。在田间正常条件下,成熟期osprr37的离体叶片失水速率和衰老速率均显著低于对照,开花时间延迟了15天左右,千粒重降低,而株高、穗长、粒长、一次枝梗数和二次枝梗数均显著高于对照。7、REC蛋白结构域研究表明,它的存在会抑制OsPRR37的表达和功能。OsPRR37的N端含有一个REC蛋白结构域,利用前期构建并获得的OsPRR37REC超表达植株材料进行耐旱性研究,发现过表达REC结构域的转基因植株会抑制OsPRR37基因的表达,其植株在苗期耐旱性降低,表明了OsPRR37REC结构域能抑制OsPRR37功能,类似于osprr37;而在OsPRR37REC超表达植株成熟期进行干旱处理,发现其耐旱性要显著高于对照,并且产量也明显增加。8、以沪旱2B为背景,通过基因组编辑技术,在OsPRR37的启动子区域成对设计了八个编辑位点和第十外显子上进行单靶点编辑,构建了四个双靶点和一个单靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过农杆菌介导法转化沪旱2B愈伤组织获得约150株转基因苗,并成功获得了多个位点发生碱基插入或缺失的突变体植株。在T1代纯合突变植株中,3对双靶点编辑的植株均实现了较长片段的碱基缺失。对获得的转基因植株田间表型进行了初步的观察,发现不同基因编辑突变体在抽穗时间、株高和分蘖数上具有较大差异,从中筛选到生育期缩短、穗型变大的植株,供后续进一步研究。综上所述,OsPRR家族基因在水稻生长发育和应对逆境胁迫中发挥着重要的作用,其中OsPRR37在水稻生长发育的各个时期和抗逆性中扮演着多种调控角色,采用CRISPR/Cas9技术来对其进行基因编辑,有望定向培育出生育期适宜、产量增加和抗逆性增强的新材料,为水稻分子精准育种打下基础。