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目的:胰腺癌是一种恶性程度极高的恶性肿瘤,约90%的病理类型为起源于腺管上皮的胰腺导管腺癌。其临床进展迅速,对放化疗不敏感,5年生存率小于5%,是美国第四位的癌症死因。研究胰腺癌发生发展的分子机制,可以为胰腺癌的治疗提供新的靶点。胰腺癌最典型的的组织学特征是肿瘤间质大量的纤维结缔组织增生。间质成分主要包括胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、免疫细胞、淋巴和血管内皮细胞等,它们构成了一个复杂的肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME),促进肿瘤的生长和转移。间质细胞和肿瘤细胞之间存在着复杂的相互作用。一方面,肿瘤细胞通过分泌促炎症因子激活PSCs。另一方面,活化的PSCs分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白和信号分子来重塑TME。PSCs可以增强胰腺癌细胞的增殖、侵袭和耐药能力,但也有研究提示PSCs在胰腺癌发展中具有保护性作用。因此,目前PSCs在胰腺癌发展中所扮演的角色仍未阐明。Bcl-2相关永生化蛋白(Bcl-2 associated athanogene,BAG)是一类进化保守的抗凋亡蛋白,BAG3是BAG家族中的一种多结构域的共分子伴侣,在细胞内的表达可由应激刺激诱导,而在骨骼肌、心肌和多种肿瘤中组成性表达,其高表达与肿瘤进展及预后不良有关。然而,对于BAG3在胰腺癌间质微环境调控中的调节作用尚不明确。本课题组在前期的研究中发现BAG3对胰腺癌的增殖有明确的调节作用并促进胰腺癌的间质纤维化。这些研究成果主要强调了肿瘤细胞高表达BAG3所起到的致癌作用,而占胰腺癌组织50%~80%的间质成分越来越受到关注,间质中的PSCs是纤维化的主要效应细胞。本文旨在研究PSCs中BAG3的表达在胰腺癌TME重塑和肿瘤进展中发挥的作用。研究方法:一、利用组织切片进行BAG3和α-SMA特异性免疫组化染色,分析30例胰腺导管腺癌患者样本中PSCs的BAG3表达。二、培养PSCs,以不同因子刺激激活PSCs,利用Western blot检测BAG3蛋白水平的变化,qRT-PCR检测BAG3总mRNA的表达。三、应用慢病毒感染的方法构建BAG3稳定敲低的PSCs,利用Western blot检测BAG3和α-SMA的蛋白水平。四、应用慢病毒感染的方法构建BAG3稳定过表达的PSCs。1、利用RTCA实验、EdU掺入实验检测BAG3对PSCs增殖的影响;2、利用RTCA、Transwell实验检测BAG3对PSCs迁移能力的影响。五、收集BAG3过表达PSCs的条件培养基,培养BxPC3、SW1990胰腺癌细胞系和PSCs。1、利用EdU掺入实验检测对胰腺癌细胞增殖的影响;2、利用Transwell实验检测对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;3、利用EdU掺入实验检测对PSCs增殖的影响;4、利用Transwell实验检测对PSCs迁移能力的影响;5、应用细胞因子抗体芯片、ELISA和DOT BLOT分析BAG3过表达PSCs蛋白分泌的变化;6、qRT-PCR检测BAG3过表达PSCs相关细胞因子的mRNA水平;7、条件培养基中添加相关蛋白的中和抗体及重组蛋白,EdU检测BAG3阳性PSCs的增殖能力,Transwell检测BAG3过表达PSCs的迁移能力和胰腺癌细胞的侵袭能力的变化。结果:1、胰腺导管腺癌组织中BAG3在活化的PSCs中表达上调;2、BAG3过表达促进PSCs自身的活化、增殖和迁移;3、BAG3过表达PSCs的条件培养基促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭;4、BAG3过表达PSCs的条件培养基促进PSCs的增殖和迁移;5、BAG3过表达PSCs的条件培养基中IL-6、IL-8、MCP1、TGF-β2和IGFBP2明显增多,而CXCL6减少;6、应用IL-6和IGFBP2中和抗体抑制BAG3过表达的PSCs的增殖;7、IL-6、TGF-β2、IGFBP2中和抗体的加入抑制BAG3过表达PSCs的迁移;8、应用IL-8、MCP1、TGF-β2、IGFBP2中和抗体抑制胰腺癌细胞的侵袭。结论:在胰腺导管腺癌中,BAG3在活化的PSCs高表达,参与PSCs的激活,促进PSCs的增殖和迁移。PSCs中BAG3的表达通过促进IL-6、TGF-β2、IGFBP2的自分泌维持PSCs的活化状态,通过IL-8、MCP1、TGF-β2和IGFBP2的旁分泌促进胰腺癌细胞的侵袭。