【摘 要】
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杨树(Populus spp.)具有生长快、耐水湿、造林易成活等特点,是长江中下游涝渍地区造林的重要的树种之一。但淹水胁迫仍是涝渍滩地杨树生长的主要限制因子,导致木材产量与生态效益的巨大损失。解析杨树的抗涝机制,发掘抗涝关键基因是杨树抗涝性育种的重要前提,具有重要的理论意义与实践价值。在前期研究中,本课题组通过对I-69(抗涝)×小叶杨(不抗涝)杂交F1群体中2个抗涝性差异显著的全同胞子代LS1(
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(No.31570665);
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杨树(Populus spp.)具有生长快、耐水湿、造林易成活等特点,是长江中下游涝渍地区造林的重要的树种之一。但淹水胁迫仍是涝渍滩地杨树生长的主要限制因子,导致木材产量与生态效益的巨大损失。解析杨树的抗涝机制,发掘抗涝关键基因是杨树抗涝性育种的重要前提,具有重要的理论意义与实践价值。在前期研究中,本课题组通过对I-69(抗涝)×小叶杨(不抗涝)杂交F1群体中2个抗涝性差异显著的全同胞子代LS1(抗涝)与LS2(不抗涝)在淹水胁迫下细根的转录组分析(RNA-Seq),筛选了一个抗涝候选基因PtERF-1。为鉴定PtERF-1基因的抗涝功能,课题组从LS1中克隆了该基因,构建了超表达(overexpression,OE)与抑制表达载体(含RNAi1和RNAi2两个载体)。在此基础上,本研究首先通过农杆菌介导的遗传转化方法,将以上3个载体分别转化南林895杨(P.×euramericana cv.’Nanlin895’),获得转基因植株。然后,通过淹水胁迫试验,从形态、生理代谢和解剖结构等方面研究了转基因和野生型南林895杨对淹水胁迫抗性的差异,鉴定了PtERF-1基因的抗涝功能。最后,采用RNA-Seq方法,研究了转基因和野生型植株在淹水胁迫7d后,细根中基因的表达情况,探索了PtERF-1基因调控杨树抗涝性的分子机制。主要研究结果如下:(1)通过农杆菌介导法,对南林895杨的叶片进行遗传转化,采用DsRed红色荧光和PCR检测,筛选得到阳性苗47株。其中,OE 阳性苗15株,RNAi1 阳性苗17株,RNAi2阳性苗15株。采用qRT-PCR的方法测定转基因株系中PtERF-1基因的表达量,结果表明RNAi2的干涉效果普遍优于RNAi1。从OE的阳性苗中挑选了PtERF-1基因表达量显著提高的3个株系OE1(69.6倍)、OE2(58.3倍)、OE8(22.9倍);从RNAi2中选取了PtERF-1基因表达量显著降低的3个株系Ri4(0.24倍)、Ri9(0.30倍)和Ri14(0.29倍),用于后续开展抗涝功能鉴定试验。(2)以野生型南林 895 杨(WT)、OE1、OE2、OE8、Ri4、Ri9 和 Ri14 为试验材料,对其组培移栽苗进行为期21 d的淹水处理,研究不同植株对淹水胁迫抗性的差异。结果表明,所有淹水植株的形态、生长量、生理生态特性和解剖结构均受到了淹水胁迫的影响。与超表达株系(OE1、OE2、OE8)相比,WT和抑制表达株系(Ri4、Ri9、Ri14)在淹水胁迫下受到的伤害更严重。淹水胁迫对抑制表达株系的形态损伤、株高与地径生长以及总生物量积累的抑制程度,比超表达株系更严重,WT居于中间。淹水胁迫导致所有植株的叶片气体交换参数、叶绿素荧光和叶绿素含量(SPAD值)出现不同程度的降低,叶片与根系的MDA含量、叶片相对电导率均有所升高。与WT和抑制表达株系相比,超表达株系的变化幅度相对较小。同时,淹水胁迫也导致植株(WT、OE1、Ri4)细根的细胞结构出现不同程度的损伤,使皮层薄壁细胞裂解,皮层结构松散。但与WT和Ri4相比,OE1淹水7 d时细根的受损程度最轻,Ri4最重,WT居中。这些结果表明,PtERF-1基因具有调控杨树抗涝性的功能,过量表达该基因可以提高杨树的抗涝性,减弱淹水胁迫造成的伤害,维持较高的生理活性与根系结构稳定性。(3)以WT、OE1、OE2、Ri4和Ri14的组培移栽苗为试材,进行7 d淹水处理(PS7)后采集细根进行RNA-Seq分析,以正常浇水处理(CK)为对照,研究PtERF-1基因调控杨树抗涝性的机制。结果表明,与对照相比,淹水胁迫导致各个植株细根中基因的表达量均发生了明显变化,这些差异表达基因在BP(biological process)、CC(cellular component)和 MF(molecular function)均有富集。通过不同株系之间的基因差异表达分析,发现在淹水胁迫下,OE1PS7 vs WTPS7、OE2PS7 vs WTPS7、Ri4PS7 vs WTPS7 和 Ri14PS7 vs WTPS7 中均差异表达的基因仅有 1 个,为Potri.014G184200。在 OE1PS7 vs WTPS7 和 OE2PS7 vs WTPS7中均差异表达的基因有4个,分别为Potri.006G01 7700、Potri.011G110000、Potri.001G098800 和 Potri.014G184200。在 Ri4PS7 vs WTPS7 和 Ri14PS7 vs WTPS7中均差异表达的基因有61个。这些基因可能与OE、RNAi2、WT株系的抗涝性存在差异有关。后续研究中还需要对这些基因的功能进行进一步的验证。
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