沙门氏菌属{Salmonella Lignieres)是日常生活中最为常见且危害较为严重的食源性致病菌之一,属于革兰氏阴性肠道杆菌(Gram-negative)。而在大多数由沙门氏菌引起的中毒事件的主要病原菌为肠炎沙门氏菌。它会造成人类伤寒、肠胃炎、感染性腹泻、发热及呕吐等状况。常规的食品中的沙门氏菌检测根据现行的国内标准GB4789.4-2010规定,大致分为细菌分离、培养与鉴定三个部分。其检测程序包括前增菌、增菌、分离、生化鉴定及血清学鉴定5个步骤,一般需耗时4-7天,检测周期较长。同时对于可疑菌落的筛选也多倚赖检测人员的经验,存在一定的不确定性。为了适应食品行业高速发展的现状、满足食品安全检验快速准确的要求,我们亟需新的检验技术手段,来监察和控制沙门氏菌的传播,保证人们日常生活工作的健康开展。PCR技术是一种分子生物学技术,在多个科研领域都有广泛的应用和深入探索。PCR技术在食源性致病菌检测中也有较多成功的应用实例。但该方法也面临着巨大的技术挑战：由于细菌的DNA有较高的稳定性,菌体死后其DNA仍可以作为PCR扩增的模板进行聚合酶链式反应,PCR方法只能检测样品中是否含有目标片段,无法对目标的存在状态提供准确的信息,无选择性扩增从而导致假阳性结果的产生。因此,PCR技术在检测食源性致病菌上有较大的限制,无法作为最主要的致病菌检测方法。如果得到阳性结果,依旧需要传统方法做验证实验。本实验以肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)菌株(ATCC13076)为实验对象,使用DNA染料EMA (Edthidium Monoazide Bromide叠氮溴化乙啶)和PMA (Propidium Monoazide Bromide叠氮溴化丙啶)预处理细菌,并与实时荧光定量PCR (Real-time Quantitative PCR)技术相结合,抑制死细菌的DNA扩增,有选择扩增活细菌的DNA,实现区分活／死细菌的目的。EMA与PMA都是核酸染料,国内外研究表明他们都具有渗透破损细胞并与DNA结合的特性,同时对于细胞壁完好的活菌的扩增反应影响较小,从而克服PCR技术无法区别活／死菌的缺点,降低PCR检测技术的假阳性率。本研究发现,使用EMA处理浓度为5×107CFU/mL的肠炎沙门氏菌,在分别进行了纯培养肠炎沙门氏菌菌液检测和实际样品加标培养检测两部分实验后,得到以下结果：(1)在生理盐水中,肠炎沙门氏菌的检出限为104CFU/mL。继续增菌培养6h后,可以检出初始浓度为101CFU/mL的肠炎沙门氏菌菌悬液；当延长增菌时间24h后,可检出的初始菌液的浓度提高到100CFU/mL。(2)在纯菌培养液实验中,使用浓度为10μg/mL的EMA,经过10mmin的暗室反应,于500w卤素灯下曝光15min的实验条件可以实现完全抑制死细胞DNA扩增的效果(Ct值>40),同时该浓度对于低浓度的活细胞的扩增无明显影响,与对照组差异不显著(p>0.05),不会影响最终定性检测的结果。(3)PMA针对相同浓度的肠炎沙门氏菌菌悬液,其对死菌的抑制效果并不理想。调节染料浓度和曝光时间也无法达到完全抑制死菌扩增的目标。这个结果表明,就肠炎沙门氏菌而言,EMA与PMA两种试剂的作用条件、效果并不相同,染料EMA是效果更好的死菌扩增的抑制剂。(4)根据纯菌液实验部分所得结论建立实验体系,在实际样品的实验部分,验证染料EMA的作用效果。分别选取冻羊肉、鲜冻禽(鸡肉)、鲜鸡蛋(蛋液)3种样品进行了加标检测实验。结果证明,使用浓度为10μg/mL的EMA,经过10min的暗室反应,于500w卤素灯下曝光15min的实验条件可以做到完全区分冻羊肉、鲜冻禽(鸡肉)、鲜鸡蛋(蛋液)样品中的死菌与活菌。该实验结果同纯菌液实验中的结果保持一致。