椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）是引起腰腿痛的主要原因之一,严重影响患者生活质量。现有的临床治疗方法中,保守治疗效果往往不理想,手术治疗存在较大风险,严重时可造成神经损伤引起功能障碍甚至瘫痪。目前,造成椎间盘退变的机制尚不清楚,治疗靶点选择有限。因此,探索治疗椎间盘退变的新机制,发现治疗新靶点迫在眉睫。已有研究表明,活性氧物质ROS（Reactive oxygen species,ROS）过量产生导致的氧化应激可通过影响椎间盘细胞衰老、炎症、自噬来加速椎间盘退变,抗氧化应激可能是延缓椎间盘退行性疾病的有效治疗靶点。因此,本研究将围绕椎间盘氧化应激机制,从临床观察及组织学特征出发,结合基础研究手段,设计并制备了一种新型复合纳米材料—碳点-普鲁士蓝纳米酶,并通过检测材料表征及体内外实验验证该纳米复合物理化性质及其清除ROS抗氧化应激,延缓椎间盘退变的功能。第一部分:腰椎间盘退变患者影像分级与组织ROS相关性分析目的:大量研究表明氧化应激与椎间盘退变密切相关,我们推测随着退变程度增高,人椎间盘髓核组织氧化应激水平也可能会出现变化。为验证这一假设,本研究通过分析不同人群椎间盘MRI影像学特征,并对相应椎间盘髓核组织手术标本ROS水平进行检测,探讨人椎间盘影像学特征随年龄增长而出现的变化,以及组织内活性氧ROS水平与退变等级的相关性。从而验证靶向氧化应激延缓椎间盘退变策略的可行性。方法:①回顾性分析不同人群腰椎MRI影像资料,将纳入人群按照青年、中年、老年年龄段分组,各年龄段组内分为患有腰椎间盘突出症人群和正常人群。使用image-j软件分析比较不同分组人群椎间盘髓核MRI T2WI上信号强度。②根据MRI Pfirrmann分级法将拟手术患者椎间盘退变等级进行分类,收集Ⅲ级、Ⅴ级术后髓核组织标本并制作冰冻切片,使用超氧化物阴离子荧光探针（Dihydroethidium,DHE）对切片进行染色。结果:①MRI分析结果:青年、中年、老年无腰突诊断人群L4-5（腰4-5）椎间盘髓核MRIT2WI上信号强度随年龄增长呈现下降趋势。同年龄组椎间盘形态比较,椎间盘突出患者病变椎间盘髓核信号强度明显下降。②Pfirrmann Ⅲ级及Ⅴ级组织冰冻切片DHE染色均呈现阳性,且PfirrmannV级退变髓核组织DHE染色阳性比例更高（74.86±3.21%vs 45.94±49.1%,P＜0.001）。结论:研究展示了不同年龄段及腰突患者椎间盘的影像学特征,MRIT2WI信号强度分析结果提示椎间盘髓核含水量随年龄增长呈现逐渐降低趋势,在腰突患者中表现更为明显,DHE染色结果提示退变组织存在不同水平氧化应激的现象。通过临床资料分析进一步证明了抗氧化应激延缓椎间盘退变策略的可行性。第二部分:碳点-普鲁士蓝复合纳米酶的制备、表征及生物相容性检测目的:目前应用于临床的天然或合成的抗氧化剂药物在体内的效率差,且缺乏靶点特异性,因此,研发能够有效抑制氧化应激,延缓组织退变的手段十分必要。随着纳米医学的发展,具类酶活性的纳米颗粒因其高效的催化效应逐渐走进人们视野,碳基纳米酶、金属纳米酶及生物源性纳米酶均显示出良好的抗氧化应激作用。结合课题组前期研究成果,我们合成了一种新型复合纳米材料:碳点-普鲁士蓝纳米颗粒（PEI-600-Fe C-dots-Prussian Blue Nanoparticles,CD-PBs）。本章节将对 CD-PBs 的制备,理化特性与生物相容性进行深入分析。方法:①材料制备与表征:制备CD-PBs纳米复合物,通过透射电镜、马尔文粒子分析仪、光电子能谱仪检测其微观结构、表面电荷、元素组成等表征。②检测类酶活性:使用总SOD活性检测试剂盒（NBT法）、溶解氧测定法、羟自由基清除能力检测试剂盒检测CD-PBs的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）类酶活性及羟自由基清除能力。③利用细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）和细胞活死染色检验CD-PBs生物相容性。结果:①CD粒径约为7-12 nm,在CD表面原位合成PB后形成的CD-PBs纳米复合物粒径约 40-50 nm,Zeta 电位由 27.42±0.26 mV 降为 11.97±0.38 mV;CD-PBs 表面有明显的Fe-C峰、Fe-N峰以及C-N峰,显示表面存在普鲁士蓝的特征峰。③CD-PBs纳米复合物相对单纯PEI-600-Fe C-dots纳米颗粒有更高的类SOD、CAT酶活,并具备羟自由基清除能力。④CD-PBs纳米复合物水溶性良好,浓度在200 μg/ml以下时细胞毒性与对照组无统计学差异（P＞0.05）。结论:我们基于水热法制备了 PEI-600-Fe C-dots,在其表面原位合成普鲁士蓝形成核壳样结构复合纳米酶CD-PBs。通过检测粒径、表面电荷、元素组成验证了复合结构的成功合成。通过CCK8、活死染色等证实该纳米复合材料具备更高效的类酶活性和良好的生物相容性。第三部分:碳点-普鲁士蓝纳米酶抗氧化应激延缓椎间盘退变目的:本部分研究拟通过体内外实验,验证制备的纳米复合物在椎间盘退变模型中通过清除ROS抗氧化应激-抗衰老作用,以期达到延缓椎间盘退变的目的。方法:①体外实验:提取、培养大鼠原代髓核细胞,通过免疫荧光染色进行细胞鉴定;H2O2处理NPCs诱导早衰,使用超氧化物阴离子DHE探针、线粒体红色荧光探针（Mito-Tracker Red CMXRos）、免疫荧光染色及实时定量 PCR（RT-qPCR）检测 CD-PBs体外抗氧化性能以及对合成分解代谢（Col-2,Aggrecan,MMP13）、炎症相关（TNF-α）蛋白及基因表达的影响;使用衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色试剂盒检测髓核细胞衰老状态。②体内实验:大鼠尾椎针刺法建立椎间盘退变模型,将实验动物分为空白对照组（Control）、退变组（DC）及治疗组（CD-PBs）,分组处理8周后通过X-ray、MRI影像学检查,以及大鼠椎间盘组织标本石蜡切片染色验证CD-PBs对椎间盘退变的延缓作用。结果:①体外实验:H2O2处理后的髓核细胞内DHE染色的平均荧光强度可达到空白对照组的6.12倍（P＜0.05）,而CD-PBs能够明显降低胞内的ROS水平（1.99倍）;H2O2处理后的髓核细胞线粒体染色平均荧光强度相比空白对照组下降约66%,CD-PBs预处理组仅下降约38%（P＜0.05）;CD-PBs可维持合成分解代谢相关基因表达平衡,抑制炎症因子TNF-α表达;H2O2处理后髓核细胞衰老染色阳性率由7.15±1.79%（空白对照组）上升至31.09±3.32%,而CD-PBs处理组可降至11.49±1.54%（P＜0.05）。②体外实验:X-ray、MRI影像测量及组织染色结果提示CD-PBs处理组椎间盘高度指数、髓核信号强度及组织学评分较退变组明显改善。结论:我们设计并制备了一种靶向氧化应激的复合纳米材料CD-PBs,通过体内外实验证明了CD-PBs具有高效类酶活性、良好生物相容性,能够清除细胞内过量ROS,维持线粒体稳态及基质合成分解代谢平衡,抑制炎症,具有抗氧化应激-抗衰老效果,从而在体内有效维持椎间盘高度、髓核含水量及改善组织学形态,证明CD-PBs对延缓椎间盘退变进程的积极效果。