随着新药不断上市及对药品安全性的日益重视，作为药物非临床研究的重要组成部分的遗传毒性检测，其检测新技术和新方法的开发成了当务之急。遗传毒性研究包括体内实验和体外实验，采用不同的实验系统预测和评价药物的潜在遗传毒性，从而降低药物在人体临床实验中的风险。　　遗传毒性试验中的体内实验非常重要，尤其体现在后续实验策略对试验方法的选择上，ICH、OECD关于遗传实验的指导原则对此有很明确的阐述。同时，为了体现动物实验的3R原则，在开发新的体内实验方法时尽可能将其结合在一般毒性实验中，实现多终点检测，最终达到减少动物使用量的目的。本研究针对现阶段遗传毒性研究的现状，建立新的遗传毒性体内检测基因突变的快捷方法，以达到上述目的。　　本研究为建立 SD大鼠体内 Pig-a基因突变实验方法开展了相关基础研究，并将其应用于药物安全性评价中。Pig-a基因是糖化磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidyl inositol，GPI）合成的关键基因，GPI合成障碍会导致细胞表面 GPI锚连蛋白（CD59、CD55、CD48等）缺失或缺损，突变表型细胞发生率（即 RBCCD59-发生率）可通过流式细胞仪检测得到，进而得到 Pig-a基因突变率。　　1.研究目的和方法　　本研究分包括 Pig-a基因突变实验方法的建立和Pig-a基因突变实验方法的应用二部分。研究内容如下：　　第一部分：实验方法的建立和优化。1）选用ENU作为阳性致突变剂，并与DMBA给药组进行比较分析。确定合适阳性剂、给药剂量（分为低剂量连续给药组、高剂量连续给药组、大剂量单次给药组）、最佳检测时间等因素。2）分别选用5周龄和9周龄 SD雄性大鼠进行自发和诱发 Pig-a基因突变实验，并进行背景数据收集。从而研究实验动物周龄对Pig-a基因检测实验的影响。3）从样本重复性检测分析、染色细胞稳定性分析、血样稳定性分析、流式细胞仪检测准确性分析等方面对Pig-a基因突变实验方法进行验证。　　第二部分：实验方法的应用。1）选用两种抗肿瘤药顺铂注射液和盐酸甲基苄肼进行检测。2）两种中药主要药理毒理成分马兜铃酸 A和雷公藤甲素进行检测。　　2.研究结果　　1）SD大鼠经 ENU暴露后，在末次给药后28天进行检测，低剂量连续给药组、高剂量连续给药组、大剂量单次给药组均得到阳性结果，RBCCD59-发生率分别为溶媒对照组的5.1倍、13.9倍和6.7倍。2）SD大鼠经 DMBA（40mg/kg/day）和ENU（100mg/kg/day）暴露后，在末次给药后28天进行检测，RBCCD59-发生率分别为溶媒对照组的8.8倍和17.2倍；在末次给药后56天，分别为溶媒对照组的25.8倍和37.4倍。3）5周龄和9周龄大鼠经 ENU（100mg/kg/day）暴露，28后 RBCCD59-发生率分别为溶媒对照组的17.2倍和11.5倍。4）SD大鼠给予顺铂注射液(2mg/kg/day和5mg/kg/day)，末次给药后28天检测，未能得到阳性结果；SD大鼠给予盐酸甲基苄肼(100mg/kg/day)，末次给药28天后 RBCCD59-发生率为溶媒对照组的3.4倍，并存在显著性差异（P<0.01）。5) SD大鼠给予马兜铃酸 A（20mg/kg/day）和雷公藤甲素（0.45mg/kg/day），28天检测均未得到阳性结果，延长检测时间至56天，亦未得到阳性结果。　　3.结论　　1）实验选用了两种遗传毒性检测常用的诱变试剂 ENU和DMBA作为阳性剂进行比较。ENU导致 SD大鼠 Pig-a基因突变发生率高于 DMBA，在后续的实验中均选择 ENU作为阳性对照。　　2）实验分别在末次给药后第1、2、4、5和8周进行流式细胞仪检测，检测结果在末次给药后第4周的检测值接近峰值，在后续的实验中选择末次给药后1、2、4周进行检测。　　3）实验选取5周龄和9周龄的SD大鼠进行实验比较，结果证实选用5周龄的大鼠检测得到的Pig-a基因突变率高于9周龄 SD大鼠，在后续的实验中选择5周龄大鼠作为实验动物。实验对正常 SD大鼠进行背景值检测，正常 SD大鼠的自发RBCCD59-发生率为12~95×10-6，为后续实验提供背景数据　　4）方法学验证：①在检测细胞数一定的前提下，样本中所含的被检目标细胞数越多，检测差异性越小。②染色细胞稳定性：样本制备完成后，在暗处的放置时间不超过3.5小时，检测结果不会出现统计学差异。③血样稳定性：抗凝血样放置冰箱不超过1小时内，同放置时间为8小时和24小时的血样检测结果相比，8小时和24小时的血样检测值升高，抗凝血样放置时间将影响检测结果的准确性。④流式细胞仪检测准确性分析：当被检目标细胞数在一定的数量时，流式细胞仪检测值同期望值之间有很高的一致性。⑤检测细胞数目：当检测细胞数为100 万时重复检测结果存在的差异性最小，在实验条件允许的情况下，尽可能的选择检测数量多的细胞数。　　5）方法应用：①顺铂注射液：对顺铂组实验动物进行血液涂片观察，发现其血细胞的形态发生很大变化，对于依靠形状大小检测来区分细胞团的流式检测方法，对其检测结果有一定的影响。在已获得的数据中，没有发现顺铂注射液有导致SD 大鼠发生 Pig-a 基因突变的潜在风险。②盐酸甲基苄肼组的检测结果高于溶媒对照组，存在显著性差异，表明盐酸甲基苄肼 SD 大鼠 Pig-a 基因突变实验结果为阳性。