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目的:①构建pcDNA5-TRIM28重组质粒,建立可诱导稳定表达pcDNA5-TRIM28-HEK293细胞系。②探讨TRIM28基因在分子水平的调控作用及其在肿瘤中的表达。③TRIM28与肿瘤相关性及机制分析。方法:首先,经PCR技术、酶切消化、测序验证和免疫印迹杂交技术,成功构建pcDNA5-TRIM28重组质粒和可诱导稳定表达TRIM28-HEK293细胞系。其次,提取TRIM28-HEK293细胞系蛋白质,同时设立对照,通过双向电泳,质谱鉴定,鉴定出TRIM28调节的靶基因,并设计靶基因引物。选取DOX最佳诱导时间(12h)和最佳诱导剂量(0.1μg/ml)诱导可稳定表达TRIM28-HEK293细胞系,提取RNA,在逆转酶的作用下反转录成cDNA,以逆转录产物为模板,由11对基因的特异性扩增引物进行荧光定量PCR扩增,验证双向电泳的结果。同时在HeLa细胞系中过表达TRIM28,转染24h后提取RNA,在逆转酶的作用下反转录成cDNA,以逆转录产物为模板,由11对基因的特异性扩增引物进行荧光定量PCR扩增,进一步验证双向电泳的结果。再次,提取7种不同肿瘤细胞系RNA,反转录成cDNA,以逆转录产物为模板,由TRIM28和内参(18S RNA)的特异性扩增引物进行荧光定量PCR扩增,通过荧光定量PCR检测TRIM28在不同肿瘤细胞系中mRNA的表达水平。同时本实验收集了11例癌旁正常乳腺组织标本和33例乳腺肿瘤组织标本,提取RNA,在逆转酶的作用下反转录成cDNA,以cDNA为模板,由TRIM28和内参(18S RNA)的特异性扩增引物进行荧光定量PCR扩增,通过荧光定量PCR检测TRIM28在癌旁正常组织和肿瘤组织中mRNA表达水平的差异。在4T1细胞系或者HeLa细胞系中过表达TRIM28,分别提取RNA及蛋白质,通过荧光定量PCR技术及Western blot技术检测TRIM28、TWIST1与肿瘤的相关性及机制。结果:成功构建pcdna5-trim28重组质粒和可诱导稳定表达trim28-hek293细胞系。将pcdna5-trim28重组质粒和pog44质粒共转染入hek-293细胞系中,用潮霉素b筛选阳性克隆。经westernblot技术检测发现,在转染了空载体的对照组flp-intmt-rextm-293细胞系中,无论加dox诱导还是未加dox诱导,都不会检测到trim28的表达。而在共转染了pcdna5-trim28重组质粒和pog44质粒的flp-intmt-rextm-293细胞系中,未加dox诱导的一组同样检测不到trim28的表达,而在加入适量dox诱导的实验组中,trim28明显有较高水平的表达。通过分析结果可以进一步证明可诱导稳定表达trim28-hek293细胞系构建成功。提取可诱导稳定表达trim28-hek293细胞系蛋白质,进行双向电泳和质谱鉴定,结果发现11个受trim28调节的蛋白质基因,其中上调基因有3个、下调基因有8个。根据双向电泳中检测出的trim28调节的11个靶基因设计引物,dox诱导稳定表达trim28-hek293细胞系,提取rna,反转录后进行荧光定量pcr检测;并在hela细胞系中过表达trim28,同样进行荧光定量pcr检测,分析结果发现部分验证了双向电泳的结果,trim28具有调控的作用,可上调或下调某些基因的表达。提取7种不同肿瘤细胞系rna,经反转录和荧光定量pcr检测发现,在mda-mb-231细胞系、t47d细胞系、mcf-7细胞系、mda-mb-435细胞系及hek293细胞系中,trim28mrna的表达水平都显著升高,这表明trim28mrna的表达与肿瘤有关。收集了11例癌旁正常乳腺组织标本和33例乳腺肿瘤组织标本,提取组织标本rna,通过荧光定量pcr检测,分析荧光定量结果发现,与正常组织标本相比,在乳腺癌肿瘤组织标本中trim28mrna的表达水平显著增高,约是正常组织trim28mrna表达的近4倍,这表明trim28的表达与肿瘤的发生发展有重要关系。在具有内源性表达twist1的4t1细胞系中过表达trim28,通过两次的westernblot结果本实验均发现,4t1细胞系过表达TRIM28后,与只转染了空载体的对照组相比,TWIST1的蛋白表达水平明显升高。通过蛋白质灰度分析发现,过表达TRIM28后,两次试验结果TWIST1蛋白水平表达都增高,分别是对照组的1.28倍和1.71倍。TWIST1是调控肿瘤发生的重要基因,过表达TRIM28后TWIST1表达相应升高,表明在肿瘤中,TRIM28的表达与TWIST1的表达具有相关性,TRIM28在肿瘤发生中起到重要作用可能是通过调控TWIST1来进行的,TRIM28能够稳定TWIST1蛋白。为了进一步验证在4T1细胞系中的实验结果,本实验又在HeLa细胞系中过表达TRIM28,通过荧光定量PCR检测及Western blot检测发现,TRIM28提高了HeLa细胞系中TWIST1的蛋白表达水平,mRNA水平的表达反而降低。结论:成功建立可诱导稳定表达TRIM28-HEK293细胞系;通过双向电泳和荧光定量PCR技术发现并检测受TRIM28调节的11个靶基因。通过提取7种不同肿瘤细胞系RNA和44例组织标本RNA,发现TRIM28在m RNA表达水平与肿瘤有相关性。通过Western blot发现TRIM28在蛋白质表达水平与TWIST 1蛋白质的表达有相关性,进一步证明TRIM28与肿瘤的相关性,TRIM28在肿瘤中发挥重要作用,但是对于TRIM28是否是通过调节TWIST调控肿瘤的发生及对于TRIM28是如何调控肿瘤发生发展的,还需要进一步的研究证明。