第一部分口腔菌群与放射性口腔黏膜炎的关系研究背景和目的头颈部恶性肿瘤的发病率正在上升,放射治疗是头颈部肿瘤（HNC）的主要方式之一,放射性口腔黏膜炎是HNC患者放射治疗期间或之后最常见同时也是限制放射治疗剂量的早期口腔毒性反应。口腔菌群与口腔黏膜炎之间有潜在的相互作用,目前的研究致力于用一些干预措施来改变口腔菌群的存在或组成,以降低口腔黏膜炎的发病率和严重性,但到目前为止还没有建立明确的指南指导临床实践。本章研究旨在探讨头颈部放射治疗对小鼠及人类口腔菌群的影响和应用口腔微生物移植后对小鼠放射性口腔黏膜炎的作用。研究方法1.头颈部放射治疗对小鼠口腔菌群的影响及正常小鼠口腔微生物移植对放射性口腔黏膜炎的影响取雄性的C57BL/6J小鼠,采用单剂量8Gy×3天伽马射线头部局部照射后建立小鼠放射性口腔黏膜炎模型,将正常饲养的健康雄性C57BL/6J小鼠麻醉后用无菌专用口腔拭子擦拭小鼠口腔（包括上颚、两颊和舌）,制备正常小鼠口腔微生物。将实验小鼠按体重平均分为三组:空白对照组,单纯照射组和照射后给口腔微生物组,取其舌进行苏木素和伊红染色以及免疫组化。取小鼠血浆和舌组织进行白介素1、6、10,肿瘤坏死因子（TNF）α和肿瘤生长因子（TGF）β的酶联免疫分析。采集新鲜的小鼠口腔样品并提取DNA进行16S核糖体RNA（16S rRNA）基因分析,评价菌群多样性。2.常规头颈部肿瘤根治性调强适形放射治疗（IMRT）对患者口腔菌群的影响及放射治疗前后口腔菌群与血浆炎症因子的关系选择2018年4月至2018年12月期间,在南方医科大学南方医院放疗科进行头颈部放射治疗的患者,患者放射治疗前、中（放射治疗第18-22次之间）及后各取一次口腔咽后壁标本,共49例,平均年龄50.35岁。放射治疗采用IMRT方法,肿瘤靶区总剂量60～70Gy。采集新鲜的口腔咽后壁菌群样品提取DNA,然后进行16S rRNA基因分析,评价菌群多样性。研究结果1.头颈部放射治疗对小鼠口腔菌群的影响及正常小鼠口腔微生物移植（OMT）对放射性口腔黏膜炎的影响头部局部照射使得小鼠外周血和舌组织的炎症相关因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α及TGF-β的水平显著升高,OMT能够显著降低上述指标的水平。照射后小鼠舌组织结构遭到破坏,OMT能显著改善照射后舌组织的结构。照射后CD45染色加深、PCNA染色变淡,OMT能够有效改善这一现象。头部局部照射小鼠与正常小鼠口腔菌群通过16S rRNA测序分析可知,头部局部照射不能显著改变小鼠口腔菌群的丰度,但显著改变了其口腔菌群的组成。头部局部照射小鼠与照射后OMT小鼠口腔菌群通过16S rRNA测序分析可知,OMT能够显著改变头部局部照射小鼠口腔菌群的丰度及组成。2.常规HNC根治性调强适形放射治疗（IMRT）对患者口腔菌群的影响及放射治疗前后口腔菌群与血浆炎症因子的关系通过16S rRNA基因测序分析了 49例头颈部放射治病人疗前、中、后的口腔菌群。经头颈部常规根治性IMRT的HNC患者口腔菌群与放射治疗前相比,放射治疗过程中、后的丰度有轻微增加（无统计学差异）,但组成发生明显改变,且同一种属细菌在放射治疗前、中、后过程中波动较大。研究结论头部局部照射小鼠OMT后能有效改善照射引起的口腔炎症。头部局部照射使小鼠口腔菌群的丰度随时间推移有轻微增加（无统计学差异）,但显著改变了其口腔菌群的组成。OMT能够显著改变头部局部照射后小鼠口腔菌群的丰度及其组成。经头颈部常规根治性IMRT的HNC患者口腔菌群与放射治疗前相比,放射治疗过程中、后的丰度有轻微增加（无统计学差异）,但组成发生明显改变,且同一种属细菌在放射治疗前、中、后过程中波动较大。第二部分口腔菌群与机体免疫水平的关系研究背景和研究目的免疫治疗己经成为HNC治疗应用前景较广的一种方法,放射治疗在肿瘤—免疫循环中可以起到非常重要的作用。免疫球蛋白和补体是体液免疫的一部分,T淋巴细胞亚群是主要的细胞免疫形式,HNC患者根治性IMRT前后通过检测上述指标的变化可以了解机体免疫水平。菌群与免疫关系密切,放射治疗前后口腔菌群变化与机体免疫水平及免疫治疗的关系还待进一步研究。本研究是通过对HNC患者根治性IMRT前后外周血免疫球蛋白、补体及T淋巴细胞亚群的检测,揭示其变化规律,分析口腔菌群与免疫细胞变化的相关性,为HNC免疫治疗提供依据。研究方法选择2018年4月至2019年2月期间,在南方医科大学南方医院放疗科进行头颈部放射治疗的患者。54例HNC患者均接受根治性IMRT,肿瘤靶区体积剂量在60Gy～70Gy。应用酶联免疫吸附测定法检测HNC患者放射治疗前后免疫球蛋白（Ig）G、A、M以及补体（C）3、C4、血清总补体活性（CH50）的浓度,应用流式细胞学方法检测HNC患者放射治疗前后外周血中T淋巴细胞亚群的比例,比较放射治疗前后上述指标的变化。从54例患者中选出放射治疗前后均进行过口腔菌群16S rRNA测序的患者,分析放射治疗前后口腔菌群与免疫细胞变化的关系。研究结果在54名不同类型的HNC患者中,与放射治疗前对比,C3、C4及CH50在放射治疗后升高,其中C4的差异有统计学意义,IgG、IgA及IgM在放射治疗后降低,三者的差异均有统计学意义。与放射治疗前对比,CD4+CD25+T细胞（Treg）、CD3+CD8+T细胞及自然杀伤细胞（NK）在放射治疗后升高,其中CD3+CD8+T细胞和NK细胞的差异有统计学意义。与放射治疗前对比,CD3+、CD3+CD4+、CD4+CD45RO+、CD4+CD45RA+、CD8+CD28+T 细胞以及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值在放射治疗后降低,其中CD3+、CD3+CD4+、CD4+CD45RA+T细胞和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值的差异有统计学意义。10例HNC患者根治性IMRT前后口腔中特定菌群的丰度与免疫细胞的浓度或比例变化具有相关性。研究结论根治性IMRT后HNC患者免疫球蛋白降低,血清中补体升高,对细胞免疫没有绝对的激活或抑制,还需进一步研究HNC综合治疗中放射治疗对免疫的作用。根治性IMRT前后HNC患者口腔中特定菌群的丰度与免疫细胞的浓度或比例变化具有相关性,提示放射治疗前后对特定口腔菌群的调节可能影响机体的免疫水平。