【摘 要】
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【目的】探讨As4S4和JQ1联合应用对抑制胃癌和肠癌细胞是否具有协同作用,研究该联合用药诱导细胞凋亡的具体通路。观察As4S4介导的mi R-4665-3p在抑制胃癌细胞侵袭和迁移的重要作用,探索其下游分子机制。【方法】不同浓度的As4S4和JQ1单药或联用处理人胃癌细胞株AGS,MGC803和肠癌细胞株HCT116,SW480 24小时后,分析比较As4S4和JQ1联合处理与对应浓度的As4S
【基金项目】
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国家自然科学基金（81274142）； 上海市自然科学基金（11ZR1423400）；
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【目的】探讨As4S4和JQ1联合应用对抑制胃癌和肠癌细胞是否具有协同作用,研究该联合用药诱导细胞凋亡的具体通路。观察As4S4介导的mi R-4665-3p在抑制胃癌细胞侵袭和迁移的重要作用,探索其下游分子机制。【方法】不同浓度的As4S4和JQ1单药或联用处理人胃癌细胞株AGS,MGC803和肠癌细胞株HCT116,SW480 24小时后,分析比较As4S4和JQ1联合处理与对应浓度的As4S4或JQ1单药处理是否存在差异。通过MTT法观察其对细胞生长增殖的影响;利用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测上述细胞株中NFAT家族经典蛋白分子NFATc1、NFATc3和NFATc4的m RNA水平及蛋白水平;通过Western blotting方法检测其对线粒体凋亡通路的关键蛋白以及细胞凋亡、侵袭和转移相关蛋白的调控。在AGS细胞中,通过DAPI染色观察药物处理后发生的核凋亡现象;运用流式细胞术观察联合用药对诱导细胞凋亡和降低线粒体跨膜电位差是否有协同效应。运用基因芯片技术筛选As4S4处理AGS细胞后发生调变的micro RNA,通过RT-PCR技术对调变的micro RNA进一步验证。在胃癌细胞AGS和MGC803中,转染mi R-4665-3p mimics:通过划痕实验、Transwell实验及细胞形态学实验,观察其对细胞侵袭能力的影响;通过Western blotting方法,检测其对细胞侵袭和转移相关蛋白的调控。研究mi R-4665-3p对As4S4的潜在靶蛋白NFATc3的影响;验证mi R-4665-3p对GO和KEGG网站预测靶基因的调控,进一步证实mi R-4665-3p是As4S4发挥抗胃癌作用的重要分子,阐明其潜在分子机制。【结果】As4S4和JQ1联合应用能协同增加细胞毒性,导致细胞存活率显著下降,诱导核凋亡的发生。As4S4和JQ1可以协同抑制NFATc1,c3,c4蛋白分子水平,并上调凋亡相关蛋白,通过激活线粒体凋亡通路,降低线粒体跨膜电位差,诱导细胞色素C释放并进一步活化凋亡效应酶Caspase-3导致细胞凋亡。Mi R-4665-3p在划痕实验和Transwell实验中能显著抑制细胞侵袭和迁移,并能抑制细胞发生上皮细胞-间充质转化。mi R-4665-3p不仅能调节与细胞侵袭和转移能力密切相关的蛋白,还能够显著下调As4S4的潜在靶蛋白NFATc3和其下游的c-Myc蛋白,同时发现GSE-1可能是mi R-4665-3p发挥作用的靶蛋白。【结论】As4S4和JQ1联合应用,可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡,协同调节凋亡相关蛋白,从而增强JQ1对肿瘤细胞的杀伤活性,为临床药物联用及增进疗效提供理论基础。此外,As4S4还可以通过上调mi R-4665-3p发挥抑制胃癌细胞侵袭和迁移的作用。
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