顺铂（cis-diamminedichloroplatinum II, CDDP）是临床广泛应用于治疗实体瘤的最有效的化疗药物之一，但是其副作用和治疗中的获得性耐药限制了它的应用。宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，顺铂作为首选化疗药物，其宫颈癌疗效是肯定的；然而，目前对其作用机制还不十分清楚。顺铂作为细胞毒性药物杀死肿瘤的作用机制被普遍接受的观点是损伤和抑制DNA的合成。顺铂诱导的DNA损伤激活了多种信号途径从而避免或促进细胞的死亡，主要是凋亡途径。最近，几个研究小组发现顺铂能够诱导内质网应激和非核依赖的凋亡信号活化。内质网是细胞内最重要的负责蛋白质折叠的细胞器，也是细胞内钙离子的储存场所，以及储存调控蛋白正确折叠的分子伴侣，这些分子在决定细胞对内质网应激（Endoplasmic Reticulum stress, ER stress）和凋亡的敏感性中发挥重要作用。内质网质量控制系统包括几种分子伴侣，它们帮助蛋白质正确折叠并通过内质网转运，同时也感知错误折叠蛋白，并进行重新折叠；如果不能完成重新折叠，就转运错误折叠蛋白通过蛋白酶体途径或自噬（Autophagy）途径进行降解。当错误折叠蛋白增加到一定程度会产生毒性作用，凋亡信号被激活，进而导致细胞死亡。内质网应激与自噬复杂网络的相互调控，导致细胞存活和死亡之间的失平衡是决定某些抗肿瘤药物疗效的重要因素之一。目前实验结果显示，内质网应激可以激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），UPR通过IRE1、PERK及ATF6三条调控途径的有序活化和整合，引起细胞自噬等适应反应，能够重建内质网的稳态；肿瘤细胞利用这些适应性，形成了针对抗肿瘤药物治疗的耐药性。当细胞损伤超过一定阈值时，受损细胞就会执行死亡程序。可见，自噬发挥死亡或保护作用的过程复杂，尤其是在肿瘤细胞中，产生的作用可能是完全相反的。因此，很难去定义自噬在疾病或肿瘤预防、治疗中的确切影响。另外，自噬调节因子与促存活或死亡因子之间的交叉对话导致大量信号互相作用，决定了细胞最终的命运。人们期望通过解密内质网应激与自噬复杂网络，有可能提高化疗药物的治疗效果或者克服肿瘤的耐药性。本实验以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象，检测了内质网-自噬途径在顺铂诱导HeLa细胞死亡中的调控作用及其机制，为顺铂杀伤肿瘤细胞的作用机制研究提供新的线索。方法(1)顺铂对HeLa细胞生长抑制作用。MTT法检测HeLa细胞生存率；倒置显微镜观察顺铂对HeLa细胞形态的影响；Hoechst33342染色观察细胞凋亡。(2) Western blot方法检测Caspase-3表达和活化；Western blot方法检测凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值、胞浆细胞色素C蛋白表达，Caspase-8和Caspase-9蛋白表达与活化；透射电镜观察细胞超微结构。(3)间接免疫荧光法检测PDI蛋白表达、Ub和p62蛋白共定位；Western blot方法检测Ub和PDI蛋白表达，Grp78、GADD153和Cleaved Caspase-4蛋白表达。(4)透射电镜观察细胞超微结构；间接免疫荧光法检测LC3和p62蛋白共定位，LC3和PDI蛋白表达；Western blot方法检测Beclin-1、LC3和p62蛋白表达，IRE1、JNK和p-JNK蛋白表达。(5)采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）和氯喹（chloroquine,CQ）与顺铂联合应用，观察自噬和内质网应激变化。透射电镜观察细胞自噬体形成；间接免疫荧光法检测LC3和PDI蛋白表达；Western blot方法检测LC3和p62蛋白表达，泛素化蛋白、Grp78、GADD153蛋白表达。(6)检测抑制自噬对顺铂诱导细胞凋亡的影响。MTT法检测自噬抑制剂（3-MA和CQ）对HeLa细胞生存率的影响；间接免疫荧光法检测Active Caspase-3蛋白表达；Westernblot方法检测Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-4蛋白表达；Hoechst33342染色观察细胞凋亡；流式细胞术定量检测细胞凋亡率。(7)观察内质网应激诱导剂衣霉素（Tunicamycin，TUNI）对顺铂诱导细胞凋亡的影响。MTT法检测细胞生存率；间接免疫荧光法检测Active Caspase-3蛋白表达；Westernblot方法检测Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-4蛋白表达；Hoechst33342染色观察细胞凋亡；流式细胞术定量检测细胞凋亡率。结果(1)顺铂明显抑制HeLa细胞的生长，对HeLa细胞的生长抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性，能够诱导HeLa细胞发生凋亡。(2)顺铂诱导HeLa细胞Bax/Bcl-2表达上调，细胞色素C释放，Caspase-3活化；顺铂引起Cleaved Caspase-9表达明显升高，Cleaved Caspase-8表达无明显变化，表明内源性线粒体途径凋亡的活化。(3)顺铂作用HeLa细胞，内质网应激标志蛋白PDI表达明显增强，泛素化蛋白和p62蛋白共定位，表明错误折叠蛋白增加并被泛素化，p62识别泛素化的错误折叠蛋白；内质网应激相关蛋白表达明显增加，说明顺铂也诱导内质网应激凋亡途径的活化。(4)顺铂作用HeLa细胞，胞内出现大量自噬泡；LC3和p62蛋白共定位；Beclin-1和LC3II蛋白表达显著增加，p62蛋白则先增加后降低；表明顺铂诱导自噬发生。同时检测到IRE1和p-JNK蛋白表达显著增加，表明顺铂诱导HeLa细胞自噬，可能是由IRE1/JNK/Beclin-1途径介导的。(5)用3-MA阻断自噬上游或CQ阻断自噬下游，自噬泡的数量出现明显变化，LC3蛋白荧光染色和LC3II转化率明显变化，p62蛋白表现为活化或降解受阻，进一步提示顺铂能够诱导HeLa细胞发生自噬。3-MA或CQ与顺铂联合应用，都可见细胞内泛素化蛋白水平增加，Grp78、GADD153蛋白表达明显增加；且在核固缩碎裂细胞可见PDI堆积，表明自噬通过清除泛素化的错误折叠蛋白，可以减弱顺铂诱导的内质网应激。(6)用3-MA或CQ阻断自噬，可以明显增加顺铂对HeLa细胞的抑制率；导致细胞Caspase-4、Caspase-3活化明显增加；激光共聚焦显微镜术和流式细胞术检测细胞凋亡率明显增加，表明自噬减少了顺铂诱导的细胞凋亡的发生。(7)内质网应激诱导剂（TUNI）显著地增加了顺铂对HeLa细胞的抑制率；显著增加Caspase-4、Caspase-3的活化；共聚焦显微镜观察及流式细胞仪检测发现细胞凋亡率显著增加。表明内质网应激诱导剂TUNI增加内质网应激水平，可以显著增加顺铂诱导的HeLa细胞凋亡。结论顺铂能够诱导HeLa细胞发生凋亡。一方面，激活经典的内源性线粒体凋亡途径；另一方面，通过增加错误折叠蛋白，导致内质网应激凋亡途径的活化。顺铂诱导HeLa细胞发生凋亡的同时，伴有自噬的发生，其调控信号可能是由IRE1/JNK/Beclin-1途径介导的。自噬通过清除泛素化的错误折叠蛋白，可以减弱内质网应激水平，减少凋亡的发生，发挥细胞保护作用。高强度的内质网应激可以显著增加顺铂诱导的细胞凋亡。抑制自噬或增加内质网应激强度都可以明显增加顺铂对HeLa细胞的杀伤，可以作为改善顺铂疗效的有效靶点。