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研究背景:截至2022年2月,2019年冠状病毒病（COVID-19）的流行已经引起了全球近4.3亿人的感染。为了有效控制这场大流行,迫切需要安全、易于生产和储存以及具有高性价比的疫苗。DNA疫苗具备以上优势,并且可以诱导高效的体液及细胞免疫应答,是控制COVID-19流行最有利的武器之一。新冠病毒DNA疫苗目前主要采用两个脯氨酸取代的全长S（S-2P）以及受体结合域（RBD）作为抗原,但未有研究对两种抗原的免疫应答进行系统性比较。此外,可能由于抗原分子量相对较小,免疫原性相对较低,尚未有以RBD为抗原的新冠病毒DNA疫苗上市。因此,为了开发基于RBD的DNA疫苗,须联合使用提高免疫原性的策略,包括提高DNA疫苗表达后抗原的分子量或使用适当的佐剂等。研究目的:选用两种抗原（全长S和RBD）以及两种免疫方式电脉冲肌肉导入和气管灌注作为新冠病毒DNA疫苗备选组合,通过比较体液及细胞免疫应答的水平筛选出最优组合;通过设计表达RBD二聚体（p RBD-Dimer）及三聚体（p RBD-Fd）的DNA疫苗以及采用p IL-2、p CCL28和p GM-CSF作为佐剂,来提高新冠病毒DNA疫苗免疫原性;系统考察p GM-CSF作为新冠病毒DNA疫苗佐剂所诱导的体液及细胞免疫应答的水平,探讨其作为新冠病毒DNA疫苗佐剂的潜力;初步对p GM-CSF诱导强大的体液及细胞免疫应答进行了机制探索。研究方法:1.确定疫苗抗原与免疫方式的最佳组合将两种抗原（全长S和RBD）以及两种免疫方式（电脉冲肌肉导入和气管灌注）进行组合,于0、14、28 d免疫小鼠,末次免疫后14 d,通过ELISA检测血清特异性Ig G抗体水平、肺泡灌洗液及鼻腔灌洗液特异性s Ig A抗体水平;通过ELISpot检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平,筛选出最佳抗原和免疫方式的组合。2.确定提高疫苗表达后抗原分子量对免疫原性的影响设计p RBD、p RBD-Dimer以及p RBD-Fd,并通过Western-Blot检测转染HEK293T细胞48 h后上清中蛋白表达情况;将p RBD、p RBD-Dimer以及p RBD-Fd于0、14、28d电脉冲肌肉导入小鼠,通过ELISA检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平;ELISpot检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平;确定后续研究所选用的抗原。3.确定细胞因子/趋化因子佐剂将p IL-2、p CCL28和p GM-CSF与p RBD联合免疫后,于0、14、28 d电脉冲肌肉导入小鼠,通过ELISA检测小鼠第二次免疫以及第三次免疫后14 d血清特异性Ig G抗体水平;ELISpot检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平;确定后续研究所选用的细胞因子/趋化因子佐剂以及免疫次数。4.p GM-CSF对p RBD的佐剂活性将p GM-CSF与p RBD联合免疫后,于0、14、28 d电脉冲肌肉导入小鼠,末次免疫后14 d以及2 m,ELISA检测血清特异性Ig G及其亚型抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17A的水平以及对T细胞表位进行鉴定;流式细胞术检测小鼠肺部CD4+TRM（CD4+CD69+）以及CD8+TRM（CD8+CD69+）应答水平;检测小鼠脾脏中Tcm(CD44highCD62L+)/Tem(CD44highCD62L-)比率,评价p GM-CSF对体液免疫以及细胞免疫应答的促进作用以及对长期免疫应答的维持作用。5.p GM-CSF提高p RBD诱导新冠病毒中和抗体的作用通过ELISA竞争抑制法检测末次免疫后14 d血清、肺泡灌洗液及鼻腔灌洗液中抗体对ACE-2与RBD结合的抑制作用;将血清样本与新冠病毒假病毒共同孵育,检测血清样本对假病毒侵染ACE2-293T细胞的阻断作用,评价新冠病毒中抗体的水平。6.p GM-CSF发挥佐剂作用的初步机制探究通过流式细胞术分析单次免疫小鼠后14 d小鼠脾脏Tfh（PD-1+CXCR5+/PD-1+CXCR5+）和GC B细胞（CD19+B220+Fas+Gr-1+）的应答水平;探究Tfh和GC B细胞在p GM-CSF发挥佐剂过程中所起的作用。研究结果1.电脉冲肌肉导入p RBD所诱导的血清特异性Ig G抗体水平在四种候选组合中最高,虽然气管灌注所诱导的s Ig A抗体水平高于电脉冲肌肉导入,但整体水平较低;电脉冲肌肉导入方式可以显著促进特异性T细胞免疫应答,且电脉冲肌肉导入p RBD和p S-2P两组所诱导的T细胞免疫应答水平无统计学差异,最终确定以p RBD作为抗原,以电脉冲肌肉导入作为免疫方式。2.p RBD、p RBD-Dimer以及p RBD-Fd在293T细胞中成功表达RBD单体、二聚体以及三聚体;p RBD、p RBD-Dimer以及p RBD-Fd免疫后所诱导血清特异性Ig G抗体水平以及脾淋巴细胞IFN-γ分泌水平之间无统计学差异,表明本研究中提高新冠病毒DNA疫苗表达后抗原分子量对免疫原性的提高无显著性影响,后续研究采用p RBD为抗原。3.p IL-2、p CCL28和p GM-CSF与p RBD联合免疫后,p CCL28未能显著诱导黏膜免疫应答;第二次免疫以及第三次免疫后14 d p GM-CSF所诱导的血清特异性Ig G抗体及脾淋巴细胞IFN-γ水平均为最高,并且三次免疫之后的免疫效果要优于两次免疫,后续研究采用三次免疫并以p GM-CSF为佐剂。4.p GM-CSF可以诱导更高的血清Ig G1、Ig G2a、Ig G2b、Ig G3抗体水平以及Ig G1/Ig G2a比值,提示p GM-CSF可能促进Th2偏向性细胞免疫应答。联合p GM-CSF免疫后脾淋巴细胞IFN-γ、IL-4及IL-17A分泌水平显著上升,提示p GM-CSF可以显著提高小鼠T细胞应答水平,进一步通过流式细胞术探究发现其分别提高了脾脏和肺CD4+及CD8+T细胞应答水平。T细胞表位鉴定结果表明p GM-CSF可以显著性提升T细胞对RBD349-366、RBD355-372、RBD517-534以及RBD523-540的识别。与单独免疫p RBD相比p GM-CSF可以维持高水平的T细胞应答水平,提高脾脏Tcm/Tem比率以及肺部TRM水平,提示p GM-CSF可以辅助p RBD长期维持高水平细胞免疫应答。5.p RBD+p GM-CSF可以显著增强小鼠血清、肺泡灌洗液及鼻腔灌洗液抗体对ACE2与RBD结合抑制作用,以及提高血清抗体对新冠假病毒感染ACE2-293T细胞的阻断作用,提示p RBD+p GM-CSF免疫后小鼠具有更高的新冠病毒中和抗体水平。6.p GM-CSF可以提高脾脏Tfh和GC B细胞比率,提示Tfh和GC B细胞对p GM-CSF提高新冠病毒中和抗体水平发挥重要作用。研究结论1.本研究构建了以p RBD为抗原,电脉冲肌肉导入为免疫方式,p GM-CSF为佐剂的新型新冠病毒DNA疫苗。2.p GM-CSF与p RBD联合免疫,可以提升血清中特异性Ig G及其亚型抗体水平,增强了脾脏以及肺部的T细胞免疫应答,提高了新冠病毒中和抗体水平,发挥了良好的佐剂作用。3.p GM-CSF可能通过提高脾脏Tfh和GC B细胞比率来发挥佐剂作用。意义本研究设计了以p GM-CSF为佐剂、以p RBD为抗原的新冠病毒DNA疫苗,并对其佐剂机制进行了初步探索,为基于RBD的新冠病毒DNA疫苗的后续开发提供基础。