早期卵裂(early cleavage,EC)即受精卵发生第一次分裂形成为2-cell胚胎。EC也是优质胚胎早期筛选的重要依据之一,而早期胚胎质量也影响到人类辅助生殖妊娠结局、克隆胚胎移植妊娠效率、体外受精胚胎移植的效率,在人类辅助生殖和动物体外胚胎生产中具有重要的研究和应用价值。本课题旨在探讨猪进行体外受精(in vitro fertilization,IVF)后胚胎早期卵裂时间与其发育潜能之间的关系。具体研究内容如下:1.猪IVF胚胎初次卵裂时间观测:对猪IVF胚胎初次卵裂的不同时间点划分为10个时间段,即18 h、18-20 h、20-22 h、22-24 h、24-26 h、26-28h、28-30 h、30-32 h、32-42 h和42-48 h后期发育情况进行检测,结果发现:猪IVF胚胎从受精以后18 h开始有卵裂出现,到48 h为止基本完成了2细胞的分裂活动。在20-32 h之间,产生卵裂的胚胎数量占卵裂胚胎总数60%-70%,32 h之后的2个时间段内,产生卵裂的胚胎数量占卵裂胚胎总数不到30%,猪IVF胚胎初次卵裂胚胎呈现一种正态分布的总体趋势。初次卵裂时间与发育成囊胚的几率密切相关,在20-22 h卵裂的胚胎,其囊胚率达到24.25%,然而超过42 h才发生初次卵裂的胚胎,大多数会在发育过程中凋亡,难以发育到囊胚期,由此可初步判断早期进行初次卵裂的胚胎所拥有的发育潜能更高。2.卵裂时间对候选基因相对表达水平的影响:本试验分为2组,即猪IVF早期卵裂胚胎组(≤24 h)和猪IVF晚期卵裂胚胎组(30-36 h)使用QRT-PCR检测方法。分别收集早、晚期卵裂胚胎的2-cell胚胎通过QRT-PCR检测方法进行候选基因差异表达分析。结果显示:猪IVF早期卵裂胚胎组(≤24 h)Oct4、Sox2和Klf4基因相对表达量均显著高于猪IVF晚期卵裂胚胎组(30-36 h)(P<0.05),其中Oct4、Sox2在猪IVF早期卵裂胚胎组(≤24 h)和猪IVF晚期卵裂胚胎组(30-36 h)之间差异极显著(P<0.01)。进一步检测凋亡相关基因发现猪IVF早期卵裂胚胎组(≤24 h)的Caspase-3基因表达量,极显著低于猪IVF晚期卵裂胚胎组(30-36 h)(P<0.01),Bcl-xl基因表达量显著低于猪IVF晚期卵裂胚胎组(30-36 h)(P<0.05)。3.猪IVF早期卵裂胚胎组和晚期卵裂胚胎组差异表达基因谱构建。对早期卵裂组(n=2)和晚期卵裂组(n=2)分别进行单细胞转录组PE150测序,每个试验获得6 G测序数据,测序原始数据质量良好(Q30≥90.76%)。经Cuffdiff进行分析发现早、晚期卵裂胚胎4个样本的转录组总库中,涵盖有123种差异基因(log2≥1,P≤0.05),包括上调35种基因和下调88种基因。通过GO功能富集分析得出,在高尔基体蛋白糖基化的调控、糖蛋白合成代谢过程调控、mRNA和RNA转运、核酸的运输等表达基因富集显著。GO功能富集到的相关基因进一步注释分析发现14种可能参与胚胎早期发育调控的基因,分别为TMEM59、ITGB1、QKI、SAR1A、HEXB、EFNA1、MRPS26、SLC16A7、MTMR8、YBX3、GLCE、ANKRA2、LCMT2、LDHB。其中TMEM59属于I型跨膜蛋白,参与高尔基体调控和蛋白质的合成代谢,具有促凋亡效果。ITGB1参与蛋白质的调控和胶原蛋白分解代谢过程,在细胞方面主要作用于细胞膜,与细胞增殖和凋亡有关。本试验结果表明,初次卵裂时间较早的猪IVF胚胎发育潜能显著高于晚期卵裂,QRT-PCR和单细胞转录组测序揭示部分基因在早期分裂的胚胎具有较高相对表达水平,这些基因在高尔基体蛋白糖基化的调控、糖蛋白合成代谢过程调控、mRNA和RNA转运、核酸的运输等富集显著。本研究为建立基于早期卵裂时间筛选发育潜能较高的猪IVF胚胎的技术奠定了基础亦对指导其他动物胚胎筛选和提高妊娠结局具有一定的参考价值,在畜牧业生产中可大大提高母猪的繁殖力和产子率。