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目的:(1)在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)动物模型及细胞模型中探讨BRCC3的表达情况;(2)在PD细胞模型中探讨BRCC3对NLRP3炎症小体复合物及IL-1β表达的影响;(3)在PD细胞模型和HEK293细胞中,探讨CDK5与BRCC3之间的关系;(4)在PD模型中探讨CDK5介导BRCC3对NLRP3炎症小体表达的影响。方法:(1)将C57BL/6J小鼠随机分为对照组和实验组,实验组按照25mg/kg*7天的剂量腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)进行PD造模,对照组注射同等剂量的生理盐水,应用Western blot检测脑组织内酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达,确定PD动物模型的建立;在大鼠神经元细胞中使用经典的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)诱导剂构建PD细胞模型,应用RT-PCR检测PD动物模型和细胞模型中BRCC3的m RNA表达水平;应用Western blot检测PD动物模型和细胞模型中BRCC3蛋白的表达;在PD细胞模型中,应用细胞免疫荧光检测BRCC3在细胞内的定位及蛋白表达情况。(2)在PD细胞模型中,分别应用去泛素化酶抑制剂(G5)或慢病毒sh RNA-BRCC3降低BRCC3的蛋白表达,应用Western blot分别检测NLRP3炎症小体复合物及IL-1β蛋白表达情况;在慢病毒sh RNA-BRCC3干预的PD细胞模型中,应用细胞免疫荧光检测NLPR3在细胞内的蛋白表达情况。(3)在PD细胞模型中,给予CDK5抑制剂Roscovitine处理,Western blot检测BRCC3蛋白表达水平的变化;在HEK293细胞中利用脂质体转染BRCC3-His质粒、CDK5-HA质粒,免疫共沉淀检测CDK5与BRCC3蛋白两者的相互作用。(4)在PD细胞模型中应用CDK5抑制剂Roscovitine抑制CDK5的表达,Western blot检测NLRP3、pro-caspase-1、ASC、IL-1β的表达;在HEK293细胞中通过脂质体共转染BRCC3和CDK5/P35质粒,并使用LPS+ATP处理,构建细胞炎症模型,Western blot检测NLRP3、pro-caspase-1、ASC的蛋白表达情况;在PD细胞模型中使用BRCC3抑制剂(G5)和sh RNA-BRCC3慢病毒感染神经元,降低BRCC3表达,应用ELISA试剂盒检测神经元中炎性因子IL-1β的分泌情况。结果:(1)成功构建PD动物模型:腹腔注射MPTP的PD动物模型具有明显的行为学损伤,如平衡杆和爬杆通过时长均较正常对照组延长,Western blot结果显示PD动物模型组TH表达降低;RT-PCR结果提示MPTP诱导的PD动物模型和MPP~+诱导的PD细胞模型中BRCC3的m RNA水平均没有显著变化,但在MPP~+构建的PD细胞模型中发现,MPP~+作用不同时间(0h,0.5h,1h,4h,8h),BRCC3的m RNA的表达水平随着MPP~+处理时间的延长而逐渐增强,作用1h达到高峰,随后又逐渐下降;Western Blot检测结果显示,MPTP诱导的PD动物模型中BRCC3表达明显增加,在PD细胞模型中,MPP~+作用不同时间(0h,2h,4h,8h,16h,32h),BRCC3蛋白在神经元中的表达水平随着时间延长而明显增加,在8h时BRCC3蛋白表达最显著;免疫荧光结果表明,BRCC3主要定位于神经元胞浆中,经过MPP~+诱导后BRCC3表达增强。(2)在PD细胞模型中分别使用去泛素化酶抑制剂(G5)处理和慢病毒sh RNA-BRCC3感染神经元细胞,抑制BRCC3蛋白的表达,Western blot结果显示,NLRP3、pro-caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达水平降低;免疫荧光结果显示,NLRP3主要定位于神经元的细胞浆中,且在抑制BRCC3蛋白表达时NLRP3表达随之降低。(3)在PD细胞模型中,给予Roscovitine抑制CDK5表达时,BRCC3表达也随之减少;在HEK293细胞中共转染BRCC3-His和CDK5-HA质粒,免疫共沉淀检测二者的相互作用情况。结果显示,CDK5和BRCC3之间存在相互作用。(4)在PD细胞模型中,应用CDK5抑制剂Roscovitine可使神经元中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、IL-1β表达降低;在HEK293细胞中共转染BRCC3-His、CDK5-HA/P35-Myc质粒并构建细胞炎症模型,结果发现过表达BRCC3可增加NLRP3炎症小体复合物的表达,当CDK5抑制剂Roscovitine抑制CDK5表达后,NLRP3炎症小体复合物的表达随之下降;此外,在PD细胞模型中,ELISA检测MPP~+处理组中炎性因子IL-1β显著增加,当应用BRCC3抑制剂(G5)或者慢病毒sh RNA-BRCC3作用于MPP~+处理的神经元,其分泌的炎性因子IL-1β均显著减少。结论:(1)成功构建帕金森模型,MPTP诱导的PD动物模型和MPP~+诱导的PD细胞模型中BRCC3蛋白表达增强;(2)PD细胞模型中BRCC3正向调控NLRP3炎性小体复合物及IL-1β蛋白的表达;(3)在HEK293细胞和PD细胞模型中CDK5调控BRCC3的表达;(4)BRCC3对NLRP3炎症小体复合物的调控作用依赖于CDK5的参与;(5)抑制BRCC3可以减少炎性因子IL-1β的分泌。