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背景及目的:脑外伤(创伤性脑损伤,Traumatic Brain Injury,TBI)是严重危害人类安康的疾病之一,对社会经济危害巨大,其颅内的损伤类型主要有两种形式,原发性和继发性脑外伤,而研究发现脑外伤后过度的炎症反应是继发性脑外伤的主要原因。然而脑外伤患者常常伴有多发伤,复合伤,使其原本的伤情变为更加复杂,因此至今为止尚无确实有效的治疗方案。在继发性脑外伤中,有多种炎性因子被假定为脑外伤预后不良的危险因素,但仍然存在争议。芬戈莫德(Fingolimod)是一种可以减轻各种炎症反应的、新型的免疫调节剂,其可通过结合鞘氨醇受体1(S1P1)来阻止淋巴细胞从淋巴组织中渗出。在临床上芬戈莫德是首个获得FDA批准的用于治疗多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)的免疫调节剂药物,而且在颅内血肿(Intracerebral Hemorrhage,ICH),局部缺血(Ischemia),脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)和许多其他中枢神经系统疾病的治疗中显示出其的治疗作用。尽管Fingolimod展示了它在神经损伤领域巨大的临床应用价值,但是,由于Fingolimod是全面抑制免疫细胞逸出淋巴器官,所以其对于炎症是全面抑制,故寻找对Fingolimid调控敏感的生物标记物较为困难。有意思的是,有研究发现Fingolimod会调控IL-1(Interleukin-1,IL-1)的家族因子IL-33(Interleukin-33,IL-33)的功能,而IL-33通常被认为在脑组织中各类细胞核中高表达,同时即可作为细胞内在因子,也可作为细胞外因子在细胞凋亡或死亡后释放到组织间,起到“警报素”的作用。有研究表明IL-33在多种神经系统疾病中具有促进和改善预后的作用,但也有关于IL-33刺激脾细胞或CD8~+T细胞产生TNF-γ的研究报告。IL-33还有广泛激活作用,是T细胞的共刺激因子,可增强T细胞分化为Th2和Treg,而激活的CD8~+T细胞则可调控IL-33受体表达。而且IL-33在肿瘤、脑缺血性损伤中均发挥关键作用,是神经免疫领域的研究热点之一,但是否可以通过检测IL-33来提示机体免疫调控状态及其在脑外伤中的意义,目前均无报道。故本研究在初步验证芬戈莫德对脑损伤的保护作用后,拟率先研究IL-33在脑外伤中的意义,为实现免疫调控治疗脑外伤的后续研究奠定基础。因此本论文将具体分为两个部分从不同角度分别探究Fingolimod与IL-33在脑外伤中的意义:第一部分探讨Fingolimod治疗能否改善神经功能,调节免疫细胞并减少炎症因子的分泌;第二部分通过临床回顾性研究,对脑外伤患者的临床数据进行回顾性分析的同时,结合了基础实验探究IL-33在脑外伤的意义,为脑外伤诊疗以及机制提供新思路。方法:第一部分:将小鼠分为假手术组(Sham-CCI),对照组(CCI+Saline)和Fingolimod治疗组(CCI+Fingolimod)。通过电控皮层打击仪(electric Cortical Contusion Injury,e CCI)系统建立C57/BL6小鼠的脑外伤模型。以1 mg/kg的剂量在受伤后1、24和48小时给予小鼠进行Fingolimod治疗。通过改良神经功能评分(Modified Neurological Severity Score,m NSS),转杆实验(Rota-rod)和Morris水迷宫(Morris Water Maze,MWM)实验评估了这些小鼠的神经功能,同时观察了脑水含量和血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)的完整性。使用抗淀粉样前蛋白抗体(Anti-Amyloid precursor protein,Anti-APP)进行免疫组织化学染色以评估轴突损伤。利用流式细胞仪,免疫荧光,细胞因子阵列和酶联免疫吸附测定实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)评估受伤大脑中的免疫细胞和炎性标志物。第二部分:收集脑外伤患者的病历及入院血清,通过ELISA方法检测血清中IL-33浓度然后运用多重线性回归分析以及多元逻辑回归分析,分别探讨血清IL-33浓度与患者入院情况和出院预后的关系。将小鼠分为假手术组(Sham-CCI),对照组(CCI+Saline)和IL-33治疗组(CCI+IL-33),各组再分为雌雄两个亚组。通过e CCI系统建立C57/BL6小鼠的脑外伤模型。以0.1mg/kg的剂量在造模前30分钟预先给小鼠治疗。通过m NSS和MWM评价各组小鼠的功能恢复情况,同时观察了脑水含量和血脑屏障的完整性。结果:第一部分:CCI+Fingolimod组神经功能优于CCI+Saline组,同时脑水肿程度和血脑屏障损害也较CCI+Saline轻。抗APP抗体检验发现Fingolimod可减少脑外伤轴突的损伤。Fingolimod可减少TBI后第3天脑组织内浸润的T淋巴细胞和NK细胞,但增加了调节性T(Treg)细胞的百分率,同时会促使小胶质细胞/巨噬细胞往M2亚群的方向分化。TBI后第3天,脑组织中炎性细胞因子和趋化因子的积累达到峰值,而Fingolimod的给药减少了多达20种细胞因子和趋化因子的同时,增加了IL-10的表达量。第二部分:通过多重线性回归分析,发现血清IL-33浓度的平方根与入院时除颅骨外其他部位骨折(P<0.01)和弥散性轴索损伤(Diffuse Axonal Injury,DAI)(P<0.05)等因素呈密切的相关性。在实验室检查的指标与出院预后的多因素逻辑回归分析中,血清IL-33浓度高低与患者出院预后正相关性最为显著(P<0.05)。e CCI动物模型中发现脑组织IL-33浓度在外伤后6小时急速升高,之后在伤后24小时和72小时逐渐降低,但始终高于正常脑组织中IL-33浓度;CCI+IL-33组神经功能优于CCI+Saline组,同时脑水肿程度和血脑屏障损害也较CCI+Saline轻;雌性小鼠搜寻水迷宫平台时间较雄鼠短,且雌性小鼠的m NSS评分较雄鼠低。结论:这项研究表明,连续3天使用Fingolimod治疗可广泛调节多种免疫炎症反应并改善TBI后的神经功能缺损,因此,它可能是治疗继发性TBI的新方法。血清中IL-33浓度可反应脑外伤患者的受伤情况及预测患者的预后;IL-33治疗可通过保护血脑屏障和减轻脑水肿从而促进脑外伤小鼠的神经功能恢复;雌性脑外伤小鼠的部分神经功能预后优于雄性小鼠。