论文部分内容阅读
硒(Selenium,Se)是人类和动物必需的微量元素,但机体无法自身合成,只能通过饮食摄入。硒在自然界中有多种形态,生物对硒的吸收和利用主要受制于其形态,有机硒在生物利用率以及生物活性等方面均显著优于无机硒。目前,针对富硒平菇及其产生的活性物质的应用研究已有很大进展。富硒平菇及其提取物可用于食品、药品、添加剂等方面。开发以富硒平菇为原料的产品具有潜在的商业价值。而对其中硒的定性定量检测却处于初级阶段,尚需有针对性地进行优化和改良。本课题以富硒平菇粉为原料,建立和优化了富硒平菇蛋白的提取工艺以及酸水解条件。同时建立了以硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)为目标化合物,通过高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测,对富硒平菇蛋白中所含有的有机硒定性定量的检测方法。并以该检测方法为手段,研究了富硒平菇蛋白提取工艺过程中提取温度、提取时间等因素对提取出的富硒平菇蛋白中有机硒的形态和稳定性的影响。主要研究结论如下:富硒平菇蛋白提取方法的选取和优化。本实验以富硒平菇粉为原料,使用超声波辅助盐提法提取富硒平菇蛋白,对提取温度、提取时间、蛋白质沉淀的p H、液固比及盐浓度进行单因素实验,最终确定超声波辅助盐提法提取富硒平菇蛋白的最适工艺条件为:提取时间120min,盐浓度0.5mol/L,液固比30m L/g,提取温度50℃,在此条件下蛋白得率为39.6%。对比纤维素酶处理、半纤维素酶处理、超声波辅助水提法、碱提法、超声波辅助碱提法和盐提法,确定超声波辅助盐提法的蛋白提取率高。蛋白提取方法对富硒平菇中硒蛋白的提取率的影响。本实验对比了不同提取方法和提取条件所得蛋白的硒含量,发现不同蛋白提取方法对富硒平菇中硒蛋白的提取率有差异。结果显示超声波辅助盐提法所得到的蛋白中硒含量最高,为70.56μg/g。HPLC-MS/MS检测有机硒方法的建立与优化。本实验通过单因素实验对比酸浓度、酸水解温度和酸水解时间三个因素与蛋白水解率以及硒代氨基酸稳定性的关系。最终确定酸水解最适条件为:盐酸浓度4mol/L、酸水解温度80℃、酸水解时间48h,在此条件下水解率为75%。选用Themo AQUASIL C18色谱柱(150×2.1mm,3μm),以1%乙腈水溶液(0.1%甲酸)和99%乙腈水溶液(0.1%甲酸)为流动相进行梯度洗脱。采用多反应监测(MRM)正离子模式,选择定量离子对(甲基硒代半胱氨酸:m/z 183.99→166.96;硒代胱氨酸:m/z336.92→247.87;硒代蛋氨酸:m/z 198.00→180.98)进行定量分析。结果表明在最佳的检测条件下,20～500ng/m L的浓度范围内,线性回归方程为分别为甲基硒代半胱氨酸:A=18636c+41678、硒代胱氨酸:A=22979c-114002、硒代蛋氨酸:A=65986c+282145,线性相关系数R均大于0.99。使用优化的HPLC-MS/MS检测有机硒方法分析富硒平菇中有机硒的存在形态及含量。结果表明富硒平菇蛋白中存在有机硒以甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸形态存在,其中硒代蛋氨酸的含量最高,可达22.91±0.82μg/g。