瘤背石磺（Onchidium reevesii）是生活于滩涂湿地的半咸水两栖生物,为腹足纲（Gastropoda）、肺螺亚纲（Pulmonata）、缩眼目（Systellommatophora）、石磺科（Onchidiidae）贝类,是一种具有很高的食用和药用价值的贝类^[1,2]。其生活分布区域常见于中国的江苏省、上海市、浙江省、福建省、广东省等地的淡水与海水交汇处的高潮带,温度适应能力十分强、分布范围广阔、野生资源量非常丰富。从形态角度观察瘤背石磺并未进化出完整的心血管系统,仅在皮肤组织内部存有少量的血窦,使其通过皮肤呼吸来获取氧气的能力不足,因而瘤背石磺进化出“肺囊”来作为身体获取氧气的主要器官。行为学上,瘤背石磺也表现出长期且精确的“归家行为”,高潮期生活在巢穴、洞穴、岩缝及植物杆上,低潮时段出来摄取暴露在潮间带滩涂泥土表面物上的腐殖质和藻类等食物,从不同巢穴中出来的石磺在潮水再次涨起的1小时前能同时回家,体现高度的精确性和复杂性。贝类平衡囊和耳石多认为是感应重力加速度和角加速度的感觉器官^[3,4],但瘤背石磺耳石结构小、不易分离获取。本实验室对瘤背石磺神经组织分离研究较为成熟,且其感知潮汐并归家离不开神经感应。为探究“归家行为”这一特殊行为习性中石磺对潮汐精准感知能力所具有的高度精确性、复杂性及其影响因素,本研究选取瘤背石磺神经组织作为研究对象,利于基因克隆、荧光定量和原位杂交技术,初步探究与瘤背石磺低频听力相关的基因,并进行兴趣基因的多时空表达分析,推测瘤背石磺感知潮汐与听力能力之间的相关性,为石磺感知潮汐并及时反应的作用机理提供基础性理论数据。本文主要研究内容如下:1、瘤背石磺OnWSF1和OnPMCA2基因的克隆及其验证克隆得到瘤背石磺OnWFS1和OnPMCA2基因全长序列为3003bp和5091bp,分别编码814和1208个氨基酸。根据氨基酸组分分析显示,OnWFS1和OnPMCA2基因编码蛋白均为稳定蛋白。软件预测OnWFS1蛋白有9个跨膜区域,为编码内质网跨膜糖蛋白;OnPMCA2蛋白有8个跨膜区域,同样为跨膜蛋白。OnWFS1和OnPMCA2蛋白在二级结构预测中含有多数的α螺旋结构,这为构成蛋白活性中心以及催化中心奠定了结构化基础。通过氨基酸序列对比发现,瘤背石磺OnWFS1和OnPMCA2都与加州海兔有较高序列同源性。对瘤背石磺其他基因所编码的氨基酸序列系统进化树分析显示瘤背石磺与加州海兔的进化关系相对较近。分析瘤背石磺蛋白腺、神经、肝胰腺、性腺、肠道、背部、腹足和口器等组织OnWFS1和OnPMCA2基因表达情况。结果显示OnWFS1和OnPMCA2基因在瘤背石磺各组织中均有表达,q RT-PCR结果显示,在石磺神经组织中OnWFS1和OnPMCA2基因的表达量都明显高于其他组织。2、不同组瘤背石磺神经组织OnWFS1和OnPMCA2基因的多时空定量分析利用低频声波发生器不同频率声波（0Hz、10Hz、40Hz、70 Hz、100 Hz、130 Hz、160 Hz、190 Hz、220Hz、250 Hz、280 Hz、310 Hz）及野外潮汐两部分干扰瘤背石磺,探讨瘤背石磺神经组织中OnWFS1和OnPMCA2基因的表达情况。通过定量分析结果可知,130Hz～310Hz频率干扰时,OnWFS1和OnPMCA2基因有显著增高的趋势,且OnPMCA2基因对160Hz到310Hz范围内的声波刺激感知更为敏感。野外的三组石磺神经组织OnWFS1和OnPMCA2基因定量分析,结果显示05月08日崇明岛当地直接采集和07月08在东海暂养两个月后采集的瘤背石磺,其神经组织OnWFS1和OnPMCA2基因表达量都与当地当日潮汐趋势基本一致,海水涨潮时,两基因高表达,海水退潮至潮水最低点期间,基因表达量相对较低。而05月18日在东海暂养10天的瘤背石磺OnWFS1和OnPMCA2与东海当日潮汐趋势并不一致,没有关联,甚至相对于退潮时,涨潮时表达量降低。3、瘤背石磺神经组织OnWFS1和OnPMCA2基因的原位杂交分析通过原位杂交实验探究空白无处理组、280Hz低频声波干扰组和东海野外潮汐干扰组三组瘤背石磺神经组织中OnWFS1和OnPMCA2基因的表达与动态分布情况。总体来说,在瘤背石磺神经节中OnWFS1和OnPMCA2基因表达较为广泛,只是杂交信号强度不同,基本表述为280Hz低频声波干扰组>东海野外潮汐干扰组>空白组,这个实验结果与本文第三章节荧光定量结果一致,实验结果可信。OnWFS1和OnPMCA2基因在瘤背石磺神经组织各神经节中的动态分布过程说明石磺对低频声波的感应在神经节之间是相互联系的,而不仅仅局限于单个神经节或者单个神经元细胞。