牛樟芝免疫调节蛋白（Antrodia camphorata immunomodulatory protein,ACA）是从牛樟芝中分离出来的一种重要真菌免疫调节蛋白。天然牛樟芝只生长于台湾特有的百年以上的牛樟树的腐朽树干。牛樟树是台湾的一种二级保护树木,禁止出口、稀有而珍贵,导致ACA药理和临床的研究数据较少。本实验共构建了p ET-32-a-ACA/BL21、p ET-32-a-ACAb/BL21和p GEX-4t-2-ACA/BL21 3个工程菌,对其进行诱导表达,筛选出最适的工程菌为p ET-32-a-ACA/BL21;优化了蛋白表达条件和培养基配方,降低了表达成本;纯化蛋白并进行了活性分析,为产业化生产ACA奠定了基础。本研究的主要成果如下:1.工程菌的构建及筛选。借助DNAworks 3.2.4软件设计引物,使用OE-RCR技术合成天然的和大肠杆菌密码子偏好性的ACA基因,分别命名为ACAb和ACA。将ACAb构建于p ET-32-a、ACA分别构建至p GEX-4t-2和p ET-32-a,转化大肠杆菌,测序后命名为p ET-32-a-ACAb/BL21、p ET-32-a-ACA/BL21和p GEX-4t-2-ACA/BL21。对3种工程菌的表达条件进行优化,探索密码子偏好性和载体对蛋白表达的影响。实验结果显示,p ET-32-a-ACA/BL21更适合rACA的诱导表达。它的最适表达条件为25℃,0.6 mmol/L IPTG,诱导时间7 h。2.完全培养基的发酵条件优化。对筛选出的工程菌p ET-32-a-ACA/BL21使用四种常用的完全培养基LB、TB、SOB和2YT进行诱导表达,相同条件下SOB的表达效果优于其它三种培养基,表达量为137.37μg/m L。为提高rACA的表达量,使用响应面法对SOB培养基进行优化。从6个影响因素出发,依次进行Plackett-Burnman实验、最陡爬坡实验、中心组合设计（CCD）响应面分析,最后得出该菌株的最佳产rACA的发酵条件:SOB培养基提高酵母粉至8.92 g/L,初始p H 7.0,接种量1%,装液量10 m L/50 m L,添加IPTG 0.42 mmol/L,温度25℃,摇床转速200 rpm,发酵时间7 h。在此条件下,工程菌p ET-32-a-ACA/BL21发酵后产rACA为187.12μg/m L,比优化前的SOB（137.37μg/m L）提高36.22%。3.廉价培养基配方优化。因为SOB培养基造价昂贵,不适合产业化生产,所以寻找一种成本低廉的培养基势在必行。以乙醇发酵废液和玉米浆为原料依次使用单因素法和响应面法对培养基配方进行优化。单因素实验显示Na Cl、KCl和Mg Cl2 3种盐可以代替微量元素,玉米浆的最适用量为8 g/L,酒精发酵废液的最适用量为500 m L/L,此时rACA的表达量为160.075μg/m L。响应面法得出最适培养基组分为:玉米浆14.11 g/L、乙醇废液209.16 m L/L、Na Cl 0.5 g/L、KCl2.5 mmol/L、Mg Cl2 10 mmol/L、p H 7.0。装液量10 m L/50 m L瓶,IPTG浓度0.4mmol/L,发酵条件为25℃、200 rpm,发酵7 h。在此条件下,工程菌p ET-32-a-ACA/BL21发酵后产rACA为181.424μg/m L,比单因素法提高11.77%,产量接近优化后的SOB。4.rACA活性检测。使用纯化的重组His-rACA（recombinant ACA,rACA）处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过测定细胞增殖能力、吞噬能力、细胞形态变化及产NO、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）等细胞因子能力的影响评估rACA的活性。结果显示纯化的His-rACA能显著促进小鼠巨噬细胞增殖,改善细胞的吞噬活性,改变细胞形态,显著诱导巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。使用rACA处理Hela细胞、Caco-2细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0检测rACA对癌细胞细胞活性影响,结果显示rACA可以不同程度抑制Hela细胞和Caco-2细胞的增殖;对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0则没有抑制作用。rACA的高效可溶性表达以及类似天然ACA的活性使它可以替代天然ACA作为制药行业的食品添加剂或者免疫调节剂,甚至可以用于药物研究。