咪唑类化合物KK-42是一种人工合成的类激素,化学结构是1-苯甲基-5-[反-2,6-二甲基-1,5-庚二烯基]咪唑（CAS:96108-89-3）,具有调节昆虫生长发育的功能。KK-42可以引起家蚕、柞蚕、蝗虫等昆虫幼虫的早熟变态（如,诱导正常的家蚕4眠蚕变为3眠蚕）;诱导天蚕、舞毒蛾卵的滞育解除;降低家蚕滞育卵的比率;阻滞家蚕蛹的发育;提高棉铃虫和麻蝇的滞育蛹的比率;延迟柞蚕、棉铃虫蛹的滞育解除。KK-42可以通过渗透的方式进入昆虫体内以行使其活性,这种特性使得KK-42在操控昆虫滞育或其它发育阶段生长发育甚至害虫防治时具有一定的前景。关于KK-42调控昆虫生长发育的作用机理,前人在内分泌学方面已经做了大量的研究工作,明确了KK-42的靶标器官是前胸腺（合成蜕皮激素的器官）,可以暂时性的抑制前胸腺的蜕皮激素合成来实现对昆虫生长发育的调控,但这一过程具体是抑制了蜕皮激素合成途径的哪一个环节,通过何种方式实现对蜕皮激素合成的影响尚不清楚尤其是缺乏分子生理学方面的证据。为了理解KK-42调控昆虫生长发育的机制,本论文以我国两种产丝昆虫大蚕蛾科的柞蚕（Antheraea pernyi）和蚕蛾科的家蚕（Bombyx mori）为试验材料,以重要内分泌器官前胸腺（prothoracic gland,PG）、咽侧体（corpus allatum,CA）和咽下神经节（subesophageal ganglion,SG）为研究对象,结合转录组学、内分泌学与实时定量PCR等技术,围绕KK-42靶标器官的转录组谱、KK-42与蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）的体外结合、KK-42对三种重要激素（蜕皮激素、保幼激素[juvenile hormone,JH]、滞育激素[diapause hormone,DH]）相关基因表达的影响等几个重要问题开展了相关研究。主要研究结果如下:1.为了探究KK-42的靶标器官前胸腺在不同滞育类型昆虫间基因表达差异,本研究进行了柞蚕（以蛹滞育）与家蚕（以卵滞育）幼虫前胸腺的比较转录组分析。结果表明,这两种昆虫的前胸腺在转录组水平的基因表达情况高度相似。几乎所有的蜕皮激素生物合成相关基因在两个前胸腺中均有较为丰富的表达。此外,两个蜕皮激素受体基因、11个保幼激素相关基因和13个生物钟相关基因在这两个前胸腺中也均有表达。q RT-PCR分析进一步证实了8个保幼激素相关基因和12个生物钟相关基因在家蚕幼虫前胸腺中的表达,且具有发育时期特异性。本部分内容明确了不同滞育类型的柞蚕与家蚕幼虫前胸腺整体基因表达的高度相似性,鉴定了柞蚕的蜕皮激素生物合成相关基因,从分子水平证实了昆虫前胸腺中确实存在一个自身的生物钟。2.为了探究分泌20E的前胸腺与分泌JH的咽侧体之间的内在联系,本研究进行了家蚕中这两个重要内分泌器官的比较转录组分析。结果发现,促前胸腺激素的受体基因Torso在前胸腺中表达,而在咽侧体中不表达。转录组与q RT-PCR分析结果发现,有6个与蜕皮激素生物合成相关基因、11个与保幼激素生物合成和调控相关基因在前胸腺和咽侧体中均有表达,说明这两个内分泌器官可能通过这些基因相互进行调控。预测的未知功能蛋白LOC114249572和多功能神经激素因子sericotropin precursor分别在前胸腺和咽侧体转录组中表达量最为丰富,表明这两个基因可能在蜕皮激素和保幼激素的生物合成过程中发挥重要的作用。本部分内容比较了前胸腺与咽侧体的整体基因表达情况,提供了部分蜕皮激素和保幼激素生物合成相关基因在前胸腺和咽侧体中均有表达的证据,同时也提供了昆虫上首个来自于单独的咽侧体的转录组数据。3.为了探讨昆虫蛹滞育期前胸腺的生理功能,本研究进行了柞蚕滞育蛹与后滞育发育蛹前胸腺的比较转录组分析。前胸腺在柞蚕蛹整个滞育期形态学上均没有发生明显变化（呈乳白色,细胞间结构松散但仍连接在一起成串状）,但滞育解除后随着发育体积开始增大（呈乳白色,但细胞已经不成串）并最后解离消失。比较转录组分析发现,前胸腺在滞育蛹与后滞育发育蛹之间的整体基因表达并无较大差异。KEGG通路分析表明,柞蚕蛹由滞育期转入后发育期的过程中与细胞活动相关的基因明显活跃,符合形态学观察中前胸腺体积在逐渐增大随后逐渐解离消失的过程。转录组测序和q RT-PCR分析均表明,5个Halloween基因（nvd、spo、phm、dib、sad）在柞蚕蛹滞育解除后表达量均开始升高,说明前胸腺细胞仍具有活性,在柞蚕蛹的滞育期仍保持着合成蜕皮激素的功能。柞蚕蛹滞育解除后,前胸腺中生物钟相关基因（Period、Timeless、Vrille、HLF[hepatic leukemia factor]）的表达量也显著上调,说明前胸腺有可能作为一个时间感受器调控着柞蚕蛹滞育的发生与解除。本部分内容探究了昆虫蛹滞育期前胸腺的整体基因表达情况,证实了蛹滞育期前胸腺细胞仍保持着合成蜕皮激素的功能。4.为了探究KK-42在哪个环节抑制蜕皮激素的合成,本研究进行了KK-42与蜕皮激素的体外反应试验,检测了KK-42处理后柞蚕蛹血淋巴中蜕皮激素的滴度变化。体外试验发现,KK-42与蜕皮激素可以直接发生反应,二者可以相互结合来抵消彼此的物质含量。体内试验发现,KK-42注射入柞蚕蛹体内后,其滴度随蛹的发育逐渐降低;KK-42处理（表型上会延迟蛹滞育解除时间）导致体内蜕皮激素滴度显著降低,之后随着蛹的发育,蜕皮激素滴度又逐渐升高。上述结果表明,KK-42很可能是通过结合蜕皮激素使其丧失活性而实现调控柞蚕生长发育（延迟蛹的滞育解除）的效果。本部分内容首次证实了在体外KK-42可以直接与蜕皮激素发生反应,明确了KK-42在柞蚕蛹体内的代谢动力学,观测到了在体内KK-42与蜕皮激素的此消彼长的关系。5.为了探讨KK-42对幼虫期20E相关基因表达的影响,本研究比较了KK-42处理组（3眠蚕）和对照组（4眠蚕）家蚕幼虫前胸腺的整体基因表达变化。比较转录组数据显示,在注释的17,335个基因中鉴定出的差异基因有3,650个,其中处理组有1,963个基因上调表达,1,687个基因下调表达。KK-42直接诱导了蜕皮激素生物合成相关基因（nvd、spo、phm、dib、sad、Cyp6u1）的下调表达,诱导6个JH相关基因（Hydroxymethylglutaryl-Co A synthase、Hydroxymethylglutaryl-Co A reductase、Mevalonate kinase、Phosphomevalonate kinase、Diphosphomevalonate decarboxylase、Short-chain dehydrogenase）上调表达,4个JH相关基因（Juvenile hormone epoxide hydrolase、Citrate（si）-synthase、ATP citrate lyase、Adenosine kinase）下调表达,并诱导了几乎所有生物钟相关基因的上调表达。本部分内容证实了KK-42也直接抑制蜕皮激素生物合成相关基因的表达。6.为了探究KK-42对胚胎发育期整体基因表达的影响,本研究检测了KK-42对无滞育期的柞蚕卵发育的影响,比较了KK-42处理组和对照组的整体基因表达变化。结果发现,2μg涂抹柞蚕卵（附肢发生期）促使胚胎提前1天孵化。转录组测序注释的17,898个基因中,共检测到差异基因4,171个,其中处理组有1,809个基因上调表达,有2,362个基因下调表达。22个上调基因定位到Drug metabolism-other enzymes（ko00983）代谢通路,说明了胚胎将渗透到其中的KK-42当作Drug逐渐代谢掉。但是,转录组测序和q RT-PCR检测均没有检测到蜕皮激素生物合成相关基因（Halloween基因）的表达。结果表明,KK-42诱导的柞蚕卵的早熟变态更多的是通过直接与蜕皮激素的结合而实现的,而不是通过抑制蜕皮激素生物合成相关基因的表达实现的。本部分内容发现了KK-42可以加速柞蚕卵的发育,明确了KK-42对柞蚕卵发育的影响是通过结合蚕卵中的20E来实现的。7.为了探讨KK-42与控制家蚕卵滞育的滞育激素基因之间的联系,本研究检测了KK-42处理后咽下神经节中滞育激素基因的响应表达情况。在KK-42所诱导的家蚕3眠蚕中,滞育激素基因的表达水平显著高于同时期的正常家蚕（4眠蚕）。KK-42可以延迟家蚕蛹的发育,也可导致柞蚕蛹滞育解除过程的延迟,在这两种蛹中滞育激素基因的表达水平均显著高于对照组。结果表明,KK-42可以诱导滞育激素基因的上调表达。本研究首次建立了KK-42与滞育激素之间的关联。8.综合现有研究结果,本论文提出了KK-42调控昆虫生长发育的新机制,即外源的KK-42不仅（i）在激素水平通过直接与20E反应而降低有效的20E的滴度,而且（ii）在基因水平也通过抑制20E生物合成相关基因的表达来影响20E的滴度;随着KK-42逐渐被代谢,前胸腺又恢复了20E的生物合成能力,从而影响昆虫的生长发育。KK-42（iii）还可以直接或间接影响其他的内分泌器官中JH生物合成与调控相关基因、滞育激素基因等的表达（诱导上调或抑制）,进而影响昆虫的生长发育。