紫锥菊(Echinacea purpurea)是近年来备受关注的一种安全、高效多功能药用植物,其具有强大的免疫调节活性。巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell, DC)同为机体免疫系统的重要成员,前者具有吞噬、分泌、组织修复、抗原递呈等多种功能,后者为专职抗原提呈细胞并能分泌多种细胞因子,两者均在非特异性免疫(先天性免疫)和特异性免疫(获得性免疫)中有重要作用。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)主要表达于巨噬细胞和DC,该类受体在识别配体后,既能够通过激活炎症因子和I型IFN分泌,启动非特异性免疫反应,又可以通过促进DC成熟并递呈抗原,启动特异性免疫反应。因此,本研究拟先以小鼠为研究材料,探讨紫锥菊提取物(Echinacea purpurea extract, EE)对其机体免疫功能和抗沙门氏菌感染能力的影响,再以小鼠巨噬细胞和DC为研究对象,研究EE对两者免疫功能的影响以及TLR信号通路在此免疫调节活动中的作用,最终结合两方面的研究结果,阐明EE调控小鼠细胞和机体免疫功能以及抗沙门氏菌感染能力的机理。主要研究内容及结果如下：(一)EE对小鼠机体免疫功能和抗沙门氏菌感染能力的影响50只体重相近的C57BL/6雌性小鼠被随机分为5组,对照组、EE组、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST)组、EE+ST组和庆大霉素(gentamycin, GM)+ST组,每组10只。对照组、EE组分别以PBS和EE (10mg)连续灌胃17天,研究EE对正常小鼠机体免疫功能的影响；ST组、EE+ST组和GM+ST组分别以PBS、EE (10mg)和PBS连续灌胃17天,并于第15天再灌胃5×10~8CFU ST感染小鼠,研究EE对小鼠机体抗沙门氏菌感染能力的影响。结果如下：EE对正常小鼠机体免疫功能的影响：(1)EE对正常小鼠生长和肠粘膜结构无显著影响,说明其对小鼠机体具有良好的安全性；(2)EE可显著提高小鼠机体免疫功能,提高其脾脏指数；(3)EE可在一定程度上可增强小鼠机体的抗体分泌功能,增加小肠分泌型IgA (secretory IgA, sIgA)分泌,但对IgG分泌没有影响；(4)EE可增强小鼠机体的非特异性免疫功能,显著上调小鼠血液、回肠、结肠、脾脏、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)和肝脏中促炎细胞因子白介素(interleukin, IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)-α、干扰素(interferon, IFN)-γ和抑炎细胞因子IL-10的表达并显著增加其回肠和结肠的NO产生。EE对小鼠机体抗沙门氏菌感染能力的影响：(1)EE可缓解ST感染对小鼠机体和免疫系统的损伤,消除鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST)感染引起的小鼠体重下降,大幅减轻ST感染引起的肠粘膜损伤以及脾脏肿大和CD4+/CD8+值下降；(2)EE可降低肠粘膜的ST感染程度,显著减少回肠和结肠粘膜的中性粒细胞浸润以及ST在结肠的定植和ST向肝脏和脾脏中的移位；(3)EE可增强ST感染小鼠机体的抗体分泌功能,显著促进IgG和sIgA分泌；(4)EE可增强ST感染小鼠机体的非特异性免疫功能,显著上调血液、脾脏、MLN和肝脏中促炎细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-y和抑炎细胞因子1L-10的表达并显著增加其回肠和结肠的NO产生。以上结果提示,EE能够通过增强小鼠的机体免疫功能,提高其抗感染能力。(二)EE对小鼠巨噬细胞免疫功能的影响本研究分别以200μg/mL和100μg/mL EE处理RAW264.7小鼠巨噬细胞系和骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMDM),研究EE对两者免疫功能的影响。结果如下：EE对RAW264.7小鼠巨噬细胞系免疫功能的影响：(1)EE对RAW264.7细胞的安全浓度为0-200μg/mL;(2) EE可激活RAW264.7细胞,显著提高酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活性；(3)EE可增强RAW264.7细胞的吞噬功能；(4)EE可增加RAW264.7细胞的细胞因子分泌,显著上调促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ抗炎因子IL-10、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1和抗病毒细胞因子IFN-p的基因表达和分泌；(5)EE可增强RAW264.7细胞的NO合成功能,显著提高诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的基因表达和活性以及NO产量。EE对小鼠BMDM免疫功能的影响：(1)EE对小鼠BMDM的安全浓度为0-100μg/mL;(2) EE可诱导小鼠BMDM发生M1型极化,显著上调M1型巨噬细胞标志基因IL-6、TNF-α、IFN-γ、iNOS和表面标志CD197的表达；(3)EE可活化小鼠BMDM,并增强其抗原递呈能力,显著提高ACP和LDH活性,上调巨噬细胞活化标志CD80、CD86和MHC-II的表面表达；(4)EE可增强小鼠BMDM的吞噬功能；(5)EE可增加小鼠BMDM的细胞因子分泌,显著上调促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、抑炎因子IL-10、TGF-β1和抗病毒细胞因子IFN-p的基因表达和分泌；(6)EE可提高小鼠BMDM的NO合成功能,提高iNOS基因表达和活性及NO产量；(7)EE可调控TLR及其衔接分子MyD88、 TRIF的基因表达,并激活信号分子ERK、JNK、p38MAPK及NF-κB,以调节小鼠BMDM的细胞因子分泌和NO合成。其中TLR-ERK通路介导了EE诱导的IL-1β,TNF-a和TGF-β1基因表达和分泌,TLR-JNK通路介导了EE诱导的IL-1β、 IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β1基因表达和分泌,TLR-p38MAPK通路介导了EE诱导的IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、TGF-β1和IFN-β基因表达和分泌,TLR-NF-κB通路介导了IL-6、IL-12、IFN-γ、IL-10、TGF-β1和IFN-β基因表达和分泌,同时,TLR-JNK通路还介导了iNOS的表达以及NO产生。以上结果提示,EE不仅能够激活小鼠巨噬细胞并增强其免疫功能,而且可以通过TLR信号通路调控其细胞因子分泌和NO合成。(三)EE对小鼠DC免疫功能的影响本研究分别以400μg/mL EE处理小鼠骨髓源DC (bone marrow-derived DC, BMDC),研究EE对其免疫功能的影响。结果如下：(1)EE对小鼠BMDC的安全浓度为0-400μg/mL;(2) EE可促进小鼠BMDC成熟,并增强其抗原递呈功能,显著上调DC成熟标志CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-II的表面表达；(3)EE降低小鼠BMDC抗原摄取能力,降低其吞噬功能和ACP活性；(4)EE可增加小鼠BMDC的细胞因子分泌,上调促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、 IFN-γ、抑炎因子IL-10、TGF-β1和抗病毒细胞因子IFN-β的基因表达和分泌；(5)EE可调控TLR及其衔接分子MyD88、TRIF的基因表达,并激活信号分子ERK、JNK、p38MAPK及NF-κB,以调节小鼠BMDM的细胞因子分泌。其中TLR-ERK通路介导了EE诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-10和TGF-β1基因表达与分泌,TLR-JNK通路介导了EE诱导的IL-1β、IFN-y和IFN-β基因表达与分泌,TLR-p38MAPK通路介导了EE诱导的IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1和IFN-β基因表达与分泌,TLR-NF-κB通路介导了EE诱导的IL-12、IFN-γ、TGF-β1和IFN-β基因表达与分泌。以上结果提示,EE不仅能够促进小鼠DC成熟并增强其免疫功能,而且可以通过TLR信号通路调控其细胞因子分泌。综上所述,EE能够激活小鼠巨噬细胞并诱导其发生M1型极化,促进小鼠DC成熟,进而增强两者免疫功能,并通过提高小鼠机体免疫功能,增加其抗沙门氏菌感染能力。