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慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是缺血性脑损害常见的病理生理状态，也是引发认知障碍、痴呆以及神经变性疾病的重要危险因素，但其中的机制至今并不明确。近年来，肠道对缺血性脑损害的影响越来越受到关注，尤其是对缺血性脑损害后引起的认知障碍，我们的研究初步揭示：1、慢性脑低灌注导致大鼠肠道黏膜屏障一定程度的损伤，2、三七总皂苷对慢性脑低灌注大鼠的认知障碍和肠黏膜屏障损伤的改善作用。根据课题组前期长达6个月的研究发现，大鼠在4周时具有有明显的空间学习和记忆功能受损及情绪唤醒障碍并伴有肠道黏膜屏障损伤，故选择4周组作为研究对象。
目的：
1、研究慢性脑低灌注状态对大鼠回肠、结肠黏膜屏障的紧密连接蛋白claudin-2及occludin表达的影响，并探讨其与认知损害之间的关系。
2、研究对慢性脑低灌注大鼠进行三七总皂苷的干预后，大鼠回肠、结肠黏膜屏障紧密连接蛋白claudin-2及occludin表达变化以及大鼠空间学习和记忆能力及情绪唤醒水平的改善情况。
3、进一步揭示脑肠相互作用关系，并探讨肠道黏膜屏障以及脑肠微生物之间的相互作用在慢性脑低灌注所致的认知损害中的作用。
方法：
参照课题组前期研究进行慢性脑低灌注大鼠模型制备：60只成年雄性SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为假手术组(n=15)、慢性脑低灌注组(n=15)、溶剂对照组(n=15)、三七总皂苷组(n=15)，采用BCCAO建立慢性脑低灌注大鼠模型，三七总皂苷组和溶剂对照组在慢性脑低灌注模型上每日分别给予5%三七总皂苷生理盐水溶液和生理盐水腹腔注射，连续4周；通过旷场实验大鼠的站立次数评估大鼠情绪唤醒水平、通过周围及中央区域活动情况评价大鼠自发性活动水平，通过物体辨别实验大鼠的物体辨别指数评估大鼠识别记忆能力、通过Morris水迷宫大鼠的逃避潜伏期、游泳总路程评估大鼠空间学习能力，通过大鼠的穿越次数和穿越潜伏期评估大鼠空间记忆能力；通过蛋白质免疫印迹实验检测肠道黏膜屏障蛋白occludin和claudin-2表达水平；通过检测血浆iFABP反映肠黏膜上皮细胞损伤情况，通过TUNEL染色检测回肠、结肠组织细胞凋亡水平；通过免疫组织化学染色原位标记肠道紧密连接蛋白occludin并量化其表达水平；通过苏木素伊红染色观察回肠、结肠黏膜屏障病理改变。
结果：
(1)慢性脑低灌注模型构建成功4周后，大鼠出现了空间学习和记忆功能障碍及情绪唤醒水平障碍，而三七总皂苷干预后慢性脑低灌注大鼠的情绪唤醒水平以及空间学习和记忆能力得到明显改善。旷场实验发现，相较假手术组站立次数[(23.58±3.15)次]，慢性脑低灌注组[(12.75±2.34)次]明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组[(12.92±1.98)次]，三七总皂苷组[(22.33±1.50)次]站立次数明显增加(p＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；相较假手术组周边区域活动时间[(202.50±33.52)s]，慢性脑低灌注组[(305.75±27.50)s]明显增加(P＜0.05)，相较于溶剂对照组[(291.49±16.21)s]，三七总皂苷组[(272.11±27.67)s]周边区域活动时间明显减少(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；相较假手术组中央区域活动时间[(32.75±5.38)s]，慢性脑低灌注组[(9.50±4.96)s]明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组中央区域活动时间[(9.45±16.45)s]，三七总皂苷组[(28.48±27.65)s]明显增加(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；物体辨别实验发现，相较假手术组物体辨别指数(0.87±0.26)，慢性脑低灌注组(0.35±0.18)明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组物体辨别指数(0.27±0.26)，三七总皂苷组(0.63±0.36)明显增加(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；Morris水迷宫前5天空间学习发现，相较假手术组，慢性脑低灌注组游泳总路程、避潜伏期明显增加(P＜0.05)，相较于溶剂对照组，三七总皂苷组游泳总路程、避潜伏期明显减少(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；第6天空间探索实验发现，相较假手术组穿越次数[(2.58±1.00)次]，慢性脑低灌注组[(1.17±1.19)次]明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组穿越次数[(1.08±0.99)次]，三七总皂苷组[(2.5±1.01)次]明显增加(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；相较假手术组穿越潜伏期[(10.13±4.26)s]，慢性脑低灌注组[(36.83±8.68)s]明显增加(P＜0.05)，相较于溶剂对照组穿越潜伏期[(34.07±9.97)s]，三七总皂苷组[(11.48±3.62)s]明显减少(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(2)对大鼠肠道组织进行蛋白质免疫印迹实验，测定各组大鼠occludin以及claudin-2表达水平。Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠claudin-2表达量依次为：0.56±0.00，0.99±0.07，1.06±0.10，0.76±0.01，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠occludin表达量依次为：1.15±0.01，0.96±0.05，0.93±0.02，1.14±0.02，与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠黏膜屏障claudin-2表达明显升高(P＜0.05)，occludin表达降低(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回肠黏膜屏障claudin-2表达降低(P＜0.05)以及occludin表达升高(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(3)对大鼠进行血浆iFABP测定，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组血浆iFABP依次为：36.65±8.11pg/ml，46.38±6.54pg/ml，42.23±10.38pg/ml，37.98±9.67pg/ml，各组间血浆i-FABP没有显著差异(P＞0.05)。
(4)对大鼠肠道进行TUNEL染色，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠细胞凋亡比例依次为：0.18±0.00，0.28±0.01，0.28±0.02，0.22±0.02，结肠凋亡比例依次为0.19±0.01，0.30±0.01，0.30±0.02，0.22±0.01。与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠、结肠黏膜屏障细胞凋亡比例明显升高(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回肠、结肠黏膜屏障细胞凋亡比例明显降低(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(5)苏木素伊红染色后进行回肠Chiu氏评分以及结肠下黏膜结缔组织厚度测量，各组间回肠Chiu氏评分没有显著差异(P＞0.05)。结肠黏膜下层结缔组织厚度依次为：249.30±58.56um，41.50±5.18um，37.99±8.31um，77.66±9.00um。与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠结肠黏膜下层结缔组织厚度明显降低(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回结肠黏膜下层结缔组织厚度明显升高(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(6)对大鼠肠道进行免疫组织化学染色，定位定量测定各组大鼠occludin表达水平，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠occludin平均光密度依次为：0.45±0.03，0.33±0.00，0.31±0.01，0.36±0.01，结肠平均光密度结果依次为：0.44±0.03，0.32±0.00，0.32±0.01，0.36±0.01，与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠、结肠黏膜屏障occludin表达水平明显降低(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回肠、结肠黏膜屏障occludin表达水平明显升高(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
结论：
1、慢性脑低灌注导致大鼠空间学习和记忆功能障碍及情绪唤醒水平障碍。
2、慢性脑低灌注导致大鼠肠黏膜屏障claudin-2表达升高，occludin表达降低，细胞凋亡水平增加，说明肠道黏膜屏障可能受到了一定程度的损伤。
3、三七总皂苷对慢性脑低灌注大鼠进行干预后，大鼠肠黏膜屏障以及大鼠空间学习和记忆功能障碍及情绪唤醒水平均得到了改善。
目的：
1、研究慢性脑低灌注状态对大鼠回肠、结肠黏膜屏障的紧密连接蛋白claudin-2及occludin表达的影响，并探讨其与认知损害之间的关系。
2、研究对慢性脑低灌注大鼠进行三七总皂苷的干预后，大鼠回肠、结肠黏膜屏障紧密连接蛋白claudin-2及occludin表达变化以及大鼠空间学习和记忆能力及情绪唤醒水平的改善情况。
3、进一步揭示脑肠相互作用关系，并探讨肠道黏膜屏障以及脑肠微生物之间的相互作用在慢性脑低灌注所致的认知损害中的作用。
方法：
参照课题组前期研究进行慢性脑低灌注大鼠模型制备：60只成年雄性SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为假手术组(n=15)、慢性脑低灌注组(n=15)、溶剂对照组(n=15)、三七总皂苷组(n=15)，采用BCCAO建立慢性脑低灌注大鼠模型，三七总皂苷组和溶剂对照组在慢性脑低灌注模型上每日分别给予5%三七总皂苷生理盐水溶液和生理盐水腹腔注射，连续4周；通过旷场实验大鼠的站立次数评估大鼠情绪唤醒水平、通过周围及中央区域活动情况评价大鼠自发性活动水平，通过物体辨别实验大鼠的物体辨别指数评估大鼠识别记忆能力、通过Morris水迷宫大鼠的逃避潜伏期、游泳总路程评估大鼠空间学习能力，通过大鼠的穿越次数和穿越潜伏期评估大鼠空间记忆能力；通过蛋白质免疫印迹实验检测肠道黏膜屏障蛋白occludin和claudin-2表达水平；通过检测血浆iFABP反映肠黏膜上皮细胞损伤情况，通过TUNEL染色检测回肠、结肠组织细胞凋亡水平；通过免疫组织化学染色原位标记肠道紧密连接蛋白occludin并量化其表达水平；通过苏木素伊红染色观察回肠、结肠黏膜屏障病理改变。
结果：
(1)慢性脑低灌注模型构建成功4周后，大鼠出现了空间学习和记忆功能障碍及情绪唤醒水平障碍，而三七总皂苷干预后慢性脑低灌注大鼠的情绪唤醒水平以及空间学习和记忆能力得到明显改善。旷场实验发现，相较假手术组站立次数[(23.58±3.15)次]，慢性脑低灌注组[(12.75±2.34)次]明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组[(12.92±1.98)次]，三七总皂苷组[(22.33±1.50)次]站立次数明显增加(p＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；相较假手术组周边区域活动时间[(202.50±33.52)s]，慢性脑低灌注组[(305.75±27.50)s]明显增加(P＜0.05)，相较于溶剂对照组[(291.49±16.21)s]，三七总皂苷组[(272.11±27.67)s]周边区域活动时间明显减少(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；相较假手术组中央区域活动时间[(32.75±5.38)s]，慢性脑低灌注组[(9.50±4.96)s]明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组中央区域活动时间[(9.45±16.45)s]，三七总皂苷组[(28.48±27.65)s]明显增加(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；物体辨别实验发现，相较假手术组物体辨别指数(0.87±0.26)，慢性脑低灌注组(0.35±0.18)明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组物体辨别指数(0.27±0.26)，三七总皂苷组(0.63±0.36)明显增加(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；Morris水迷宫前5天空间学习发现，相较假手术组，慢性脑低灌注组游泳总路程、避潜伏期明显增加(P＜0.05)，相较于溶剂对照组，三七总皂苷组游泳总路程、避潜伏期明显减少(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；第6天空间探索实验发现，相较假手术组穿越次数[(2.58±1.00)次]，慢性脑低灌注组[(1.17±1.19)次]明显减少(P＜0.05)，相较于溶剂对照组穿越次数[(1.08±0.99)次]，三七总皂苷组[(2.5±1.01)次]明显增加(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)；相较假手术组穿越潜伏期[(10.13±4.26)s]，慢性脑低灌注组[(36.83±8.68)s]明显增加(P＜0.05)，相较于溶剂对照组穿越潜伏期[(34.07±9.97)s]，三七总皂苷组[(11.48±3.62)s]明显减少(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(2)对大鼠肠道组织进行蛋白质免疫印迹实验，测定各组大鼠occludin以及claudin-2表达水平。Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠claudin-2表达量依次为：0.56±0.00，0.99±0.07，1.06±0.10，0.76±0.01，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠occludin表达量依次为：1.15±0.01，0.96±0.05，0.93±0.02，1.14±0.02，与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠黏膜屏障claudin-2表达明显升高(P＜0.05)，occludin表达降低(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回肠黏膜屏障claudin-2表达降低(P＜0.05)以及occludin表达升高(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(3)对大鼠进行血浆iFABP测定，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组血浆iFABP依次为：36.65±8.11pg/ml，46.38±6.54pg/ml，42.23±10.38pg/ml，37.98±9.67pg/ml，各组间血浆i-FABP没有显著差异(P＞0.05)。
(4)对大鼠肠道进行TUNEL染色，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠细胞凋亡比例依次为：0.18±0.00，0.28±0.01，0.28±0.02，0.22±0.02，结肠凋亡比例依次为0.19±0.01，0.30±0.01，0.30±0.02，0.22±0.01。与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠、结肠黏膜屏障细胞凋亡比例明显升高(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回肠、结肠黏膜屏障细胞凋亡比例明显降低(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(5)苏木素伊红染色后进行回肠Chiu氏评分以及结肠下黏膜结缔组织厚度测量，各组间回肠Chiu氏评分没有显著差异(P＞0.05)。结肠黏膜下层结缔组织厚度依次为：249.30±58.56um，41.50±5.18um，37.99±8.31um，77.66±9.00um。与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠结肠黏膜下层结缔组织厚度明显降低(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回结肠黏膜下层结缔组织厚度明显升高(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
(6)对大鼠肠道进行免疫组织化学染色，定位定量测定各组大鼠occludin表达水平，Sham组、CCH组、RJ组、PNS组回肠occludin平均光密度依次为：0.45±0.03，0.33±0.00，0.31±0.01，0.36±0.01，结肠平均光密度结果依次为：0.44±0.03，0.32±0.00，0.32±0.01，0.36±0.01，与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠、结肠黏膜屏障occludin表达水平明显降低(P＜0.05)，而三七总皂苷干预后，相比溶剂对照组，大鼠回肠、结肠黏膜屏障occludin表达水平明显升高(P＜0.05)，慢性脑低灌注组和溶剂对照组无统计学差异(P＞0.05)。
结论：
1、慢性脑低灌注导致大鼠空间学习和记忆功能障碍及情绪唤醒水平障碍。
2、慢性脑低灌注导致大鼠肠黏膜屏障claudin-2表达升高，occludin表达降低，细胞凋亡水平增加，说明肠道黏膜屏障可能受到了一定程度的损伤。
3、三七总皂苷对慢性脑低灌注大鼠进行干预后，大鼠肠黏膜屏障以及大鼠空间学习和记忆功能障碍及情绪唤醒水平均得到了改善。