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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)为兼性胞内寄生菌,在土壤、污水等自然界中广泛存在,可以通过污染的乳制品或肉类等食物感染人和动物,是一种重要的食源性人兽共患病原菌。在Lm多种毒力因子的协同作用下,能够穿越宿主的肠道屏障、血脑屏障、血胎屏障,引起败血症、脑膜炎、流产为特征的李斯特菌病,孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下者为易感人群。Lm被机体摄入后,能够在宿主细胞内增殖,并且逃离宿主吞噬体,同时利用宿主肌动蛋白聚集成彗星尾状结构,从而在胞质内运动及在细胞间扩散传播。这种聚集宿主肌动蛋白的过程需要肌动蛋白聚集因子ActA的参与,因此ActA被认为是Lm逃离宿主自噬和在细胞间运动过程中最为重要的毒力因子。ActA蛋白根据功能分为3个功能区：氨基端、脯氨酸重复区与羧基端,其中脯氨酸重复区具有4个脯氨酸重复序列(Proline repeated regions, PRRs),主要与细菌的胞内运动与肌动蛋白尾的形成有关。并不是所有的Lm菌株,都具有完整的4个PRRs,有些菌株缺失1或2个PRR s,这种缺失对致病性的影响存在争议。本文以天然缺失1个PRR的4b血清型菌株LmNTSN作为研究材料,以其ActA蛋白作为研究对象,使用非吞噬细胞及小鼠作为实验模型,深入研究4b型菌株ActA蛋白脯氨酸重复区的功能,为揭示ActA的致病机理提供了新认识。1Lm菌株actA基因转录表达分析及其突变株的构建以人结肠腺癌细胞系Caco-2作为为体外感染模型,利用实时荧光定量PCR的方法,对Lm NTSN侵袭Caco-2细胞后的26种毒力及毒力相关基因(actA、hly、 mpl、prfA、plcA、 ami、dltA、 flbpA、hfq、inlC、inlH、inlK、sigB、virR、virS、lntA、oppA、prsA2、aut、pdgA、 srtA、mprF、murA、secA2、sod、vip)的转录表达特性进行研究。结果显示,在体外感染条件下,Lm感染Caco-2细胞后其actA基因上调表达320倍,virS、vip、mpl、plcA、lntA、 inlK、inlC基因也均显著上调表达。提示了actA等8个毒力基因在侵袭非吞噬细胞过程中发挥了重要作用。对NCBI数据库中58株Lm的ActA蛋白的氨基酸序列比对结果显示,22株Lm在脯氨酸重复区存在35aa缺失,恰好形成一个PRR,其中包括本实验室分离的4b血清型菌株Lm NTSN,而国际通用的1/2a型标准菌株EGDe则具有完整的4个PRRs。进一步分析其来源与血清型,22株脯氨酸重复区缺失的菌株中有7株为4b血清型,均为从患李斯特菌病的人或动物分离的菌株。值得一提的是,在所有谱系Ⅰ(37.9%)和谱系Ⅱ(32.7%)的菌株中,谱系Ⅰ中脯氨酸重复区缺失菌株(59%)的比例显著高于谱系Ⅱ中的菌株数量(9%),提示这种PRR的缺失具有谱系特异性。为了研究ActA脯氨酸重复区的功能,本研究利用同源重组技术构建了三株突变株：修复了PRRs序列的替换突变株Lm NTSN(actA-105),将Lm EGDe的actA基因替换到LmNTSN基因组中的替换突变株Lm NTSN(actA-FL), act A基因的缺失突变株Lm NTSN△actA。以actA外侧基因序列的PCR扩增与基因测序,证实三株突变株均构建成功,为ActA脯氨酸重复区的研究提供了生物材料。2 ActA蛋白脯氨酸重复区的功能研究对BHI培养基中Lm生物膜形成能力进行测定,结果表明,actA基因缺失株形成生物膜的能力显著下降(P<0.01),提示actA基因能够促进4b血清型菌株Lm NTSN体外生物膜的形成。选用人宫颈癌细胞系Hela作为体外感染模型进行细胞黏附、侵袭实验。结果显示,与野生株相比,Lm NTSN(actA-105)对细胞黏附侵袭的能力均显著降低(P<0.05)。空斑形成试验表明,Lm NTSN△actA不能形成空斑,而Lm NTSN、NTSN(actA-105)、NTSN(actA-FL)均能有效的形成空斑,但与野生株相比,Lm NTSN(actA-105)形成空斑数量较少,且空斑直径显著减小(P<0.001)。细菌感染Hela细胞后形成肌动蛋白丝的结果显示,Lm NTSNAactA不能聚集肌动蛋白；而Lm NTSN(actA-105)聚集肌动蛋白的能力弱于野生株和L m NTSN(actA-FL),不能形成肌动蛋白丝或形成的肌动蛋白丝较短；NTSN(actA-FL)聚集肌动蛋白的能力与野生株无明显差异。提示缺失1个PRR的野生株Lm NTSN对非吞噬细胞具有更强的黏附侵袭能力,且肌动蛋白的聚集与肌动蛋白尾的形成能力更强。此外,以小鼠为体内感染模型,通过LD50及不同感染途径下脏器细菌载量的测定,对野生株与突变株的致病力进行了研究。LD50结果显示,Lm NTSN△actA的毒力比野生株降低了247倍,Lm NTSN(actA-105)、NTSN(actA-FL)的毒力与野生株没有明显差别。在口服(i.g.)、腹腔(i.p.)和尾静脉(i.v.)三种感染途径下,Lm NTSN(actA-105)在脾脏中定植的细菌载量均显著高于野生株(i.g.:P<0.05；i.p.:P<0.05；i.v.:P<0.01),且在口服感染途径下肝脏中的载菌显著高于野生株(P<0.01)；Lm NTSN(actA-F L)在脾脏中的细菌载量均显著高于野生株(i.v.:P<0.01；i.p.:P<0.01；i.g.:P<0.05),且口服和腹腔感染途径下肝脏中的载菌量显著高于野生株(i.p.:P<0.01；i.g.:P<0.05)。综上所述,Lm NTSN(actA-105)与Lm NTSN(actA-FL)在小鼠脏器中的定植能力均高于野生株,提示完整的PRRs更有利于细菌在小鼠体内的定植。本研究对4b型菌株Lm NTSN的ActA蛋白脯氨酸重复区的功能进行了初步研究,体外感染实验结果表明,脯氨酸重复区的缺失,对于Lm NTSN黏附、侵袭非吞噬细胞及细胞中的运动过程中均发挥重要作用。但在小鼠的体内感染过程中,不同感染途径下,修复了脯氨酸重复区的菌株在小鼠脏器中的定植能力均强于野生株,表明完整的脯氨酸重复区更有利于细菌在宿主体内的定植。以上研究提示ActA蛋白完整的脯氨酸重复区有助于Lm在体内的定植、扩散和传播,对小鼠的毒力和致病力的作用机制还有待于今后深入研究。