研究背景：慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)是许多病因导致的进行性疾病,发病的早期大多数无临床症状,由于肾脏的储备功能,早期血肌酐常维持在正常范围内,一旦出现临床症状或血肌酐明显升高,疾病往往是发展到中晚期阶段。慢性肾脏病如不能早期诊断,去除病因或予以干预治疗,最终会发展到终末期肾病(End-stage renal diasease,ESRD),即尿毒症期,治疗上只能行肾脏替代治疗：腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)或血液透析(hemodialysis,HD),或是行肾脏移植。因肾脏具有内分泌、维持内环境稳定等功能,一旦肾脏疾病发展到ESRD,肾脏所有功能随之丧失,伴随而来的就是患者出现贫血、体内电解质紊乱、钠水潴留、高血压、心功能衰竭等一系列并发症,行长期透析出现的高磷血症、转移性钙化等并发症,上述并发症均可降低患者的生活质量、缩短寿命；目前我国患有尿毒症需等待肾移植患者约150万,并且以每年10-15万的速度增加,近年来,慢性肾脏病患者逐渐趋于年轻化,最小患者不到10岁,这关系到一个国家未来的发展。而因肾源的短缺,每年行肾移植术仅1万例左右,远远不能满足需求,此外,肾移植术后须长期服用抗排斥药物,致患者免疫功能较正常人低下,易出现感染等并发症,严重可危及生命,同时,绝大多数患者根本不能承担肾移植术及术后高额的治疗费用。肾脏替代治疗高昂的费用已成为整个家庭和社会巨大的经济负担,慢性肾脏病已成为威胁人类健康重要的公共卫生问题。因此,在慢性肾脏病发病的早期予以诊断并给予治疗,延长肾脏寿命,推迟或避免行肾脏替代治疗,是提高患者生活质量、延长生命、减少肾脏替代治疗并发症的关键,同时也是减轻家庭和社会负担的重要举措。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)是进行性肾脏病发生和发展过程中肾脏组织发生的主要病理改变,是许多病因导致肾功能衰竭的共同途径,主要是在疾病的进展中损伤因素与修复因素不断作用的结果,其组织病理改变主要表现为细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)成分的生成和降解失衡,导致ECM成分增加,其机制复杂[21。微小RNA (microRNA, miRNA)家族的发现成为近几年研究器官纤维化的热点,相关研究表明miRNA家族可能与肝脏、心脏、肺、肾脏、皮肤等器官纤维化有关[3-71,且miRNA在血液循环、组织、尿液或其他体液中能够稳定存在,因此国内外许多研究开始探讨其作为生物学标志物来反映某些疾病病变及病情程度的可能性,尤其是在器官纤维化的研究方面比较突出,并试图从miRNA参与器官纤维化的发生和发展的机制方面寻求治疗纤维化疾病的新靶点。研究证实,转化生长因子-β(transforming growth factor beta, TGF-β)/Samds信号通路通过调控IniRNA参与RIF的发生。研究目的：本研究通过检测建模后3、7天末假手术(sham operation, Sham)组和单侧输尿管梗阻(unilateral urethral obstruction, UUO)组血浆及术侧肾脏组织中microRNA-29c (miR-29c)、术侧肾脏组织RIF程度、纤维化相关指标：E-钙蛋白(E-cadherin)、胶原蛋白-I(collagen protein-I,Col-I)、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、TGF-β1、Smad3蛋白的表达水平。分析miR-29c与RIF程度、E-cadherin、Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白之间的关系。探讨miR-29c作为诊断RIF特异性循环学诊断标志物的可能性；拟进一步阐明RIF的病理机制,为临床防治RIF提供相应的理论和新的治疗靶点。研究方法：1.UUO模型的建立：20只SD雄性大鼠随机分为2组,即Sham组和UUO组,各组10只。3%戊巴比妥钠溶液按0.5nl/100g腹腔注射麻醉,取左侧腹肾区约2-3cm切口进入腹腔,找到左侧髂血脉,根据输尿管跨过髂血管的解剖标志,找到左侧输尿管并游离至肾盂处,UUO组分别于近左肾盂处和输尿管上1/3水平处使用0号丝线结扎,Sham组仅游离左侧输尿管不结扎,逐层缝合腹壁,术后将2组大鼠放置于清洁干燥环境中,自由进食水,两组大鼠均在同等条件下饲养。2.大鼠血液及术侧肾脏组织标本获取：术后第3、7天末,分别从2组大鼠中随机抽取5只大鼠,3%戊巴比妥钠溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉满意后,以组织剪于腹壁正中纵行剪开腹腔和胸腔,游离出心脏,采血针从心尖部位插入左心室,取血2-3ml置于EDTA抗凝管中,1200r/min离心后分离出血浆,置于-80℃冰箱保存备用,取血完毕后立即将灌注针于采血针部位插入至主动脉弓,使用冰盐水行心脏灌注,直至双侧肾脏变苍白,然后取出术侧肾脏,获取约2mm厚肾脏组织,分别置于4%多聚甲醛液和RNAlater保存液中,放在-80℃冰箱中保存备用。3.大鼠术侧肾脏组织病理检查3.1 Masson、HE染色：对术后3天末和7天末Sha m组和UUO组经4%多聚甲醛固定的肾脏组织行Masson、HE染色,HE染色观察各时间点大鼠肾脏组织结构的改变,判断建模是否成功；Masson染色主要评估RIF程度,计数算肾间质纤维化指数(%),依据肾间质纤维化指数进行分级,按Banff07RIF评分标准对肾脏组织纤维化程度进行半定量评分：每个标本在光镜下随机选取10个不重复的肾皮质区(×200),进行拍照,采用IPP6.0 (Image-Pro Plus 6.0)图像分析软件计算每个视野纤维化面积占该视野的百分比,根据如下标准计算每个视野纤维化分值：无损伤,间质纤维化少于皮质区5%,0分；轻度损伤,间质纤维化占皮质区的6%-25%,1分；中度损伤,间质纤维化占皮质区26%-50%,2分；重度损伤,间质纤维化大于皮质区50%,3分,把10个视野分值求和后取平均值,得到该切片的纤维化分值。3.2肾脏组织免疫组化：采用EliVision法,即3μm石蜡切片脱蜡至水,枸橼酸缓冲液沸水煮20min修复抗原,3%过氧化氢灭活内源性酶,分别加入兔抗人Col-I单克隆抗体(1：200稀释)、兔抗人E-cadherin单克隆抗体(1：200稀释)兔抗人α-SMA单克隆抗体(1；200稀释)、兔抗人TGF-β1多克隆抗体(1：200稀释)、兔抗人Smad3多克隆抗体(1；200稀释)后4℃孵育过夜,滴加聚合物增强剂后滴加酶标抗鼠/兔聚合物,DAB显色,显微镜下控制显色反应；苏木素复染,中性树胶封片。采用IPP6.0图像分析软件,每个标本随机选取10个不重复视野(×200),所有抗体阳性表达部位呈黄色,计算每个视野中阳性面积所占视野的百分比。4.血浆及肾脏组织miR-29c表达的测定：经匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀步骤提取血浆及肾脏组织中的样品RNA；以RNA为模板、RT混合液为反应液、使用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)扩增仪进行RT反应,逆转录合成cDNA。将所有cDNA样品分别配置qRT-PCR反应体系。体系配置如下：2×Master Mix5μl, 10uM的PCR特异引物F0.5μl, 10uM的PCR特异引物R0.5,加水至总体积为8μl,将溶液混合,5000r/min短暂离心。将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中,再加入对应的2μlcDNA,粘上Sealing Film封口膜,并短暂离心混合。将上述384-PCR板置于qRT-PCR仪上进行PCR扩增反应,反应结束后对PCR产物进行溶解曲线分析,以U6为内参,3天对照组为基准,结果采用2-△△CT表示。5.统计学分析：采用SPSS13.0软件系统分析。所有计量数据均以x±s表示,两组间比较采用完全随机设计t检验,相关性分析采用s pearman相关系数进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果：1.Sham组,术后3天和7天末术侧肾脏与对侧肾脏比较无明显变化：肾脏无增大、无积水；UUO组,术后3天和7天末术侧肾脏较对侧明显增大,有明显肾积水,术后7天末相对术后3天末肾脏增大和肾积水更加明显；2.观察HE染色切片：Sham组术后3天、7天末肾单位大小、形态均未见异常,UUO组术后3天末见肾小管轻度扩张、小管上皮空泡样变,间质轻度水肿并散在炎性细胞,术后7天末即可观察到明显的肾间质增宽、胶原沉积增加、肾小管萎缩、炎症细胞浸润明显；3.观察Masson染色切片,Sham组术后3天和7天末Masson染色无变化,肾单位及间质未见异常。UUO组术后3天末,可见肾小管管腔轻度扩张,部分间质可见少量淡蓝色胶原组织沉积,UUO组术后7天末,肾小管较3天末明显扩张,间质水肿增宽明显伴单核细胞及淋巴细胞广泛浸润,间质胶原纤维进行性增多、面积扩大、蓝染加重；4.两组术后同时间点比较,UUO组RIF半定量评分显著高于Sham组(P<0.01),血浆及肾脏组织中miR-29c和组织中E-cadherin的表达量显著低于Sham组(P<0.01),组织中Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的表达量显著高于Sham组(P<0.01)；5.UUO组术后7天末与3天末比较,RIF半定量评分显著增加(P<0.01),血浆和肾脏组织miR-29c以及组织E-cadherin表达量均是显著降低(P<0.01),组织中Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表达量显著升高(P<0.01), Sham组以上指标均无变化；6.相关性分析：UUO组血浆和组织中miR-29c表达量一致性下降,与组织中E-cadherin表达量的下降呈正相关(r=0.633、0.672,P<0.01),与RIF程度呈负相关(r=-0.581、-0.712,P<0.01),与组织Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表达量的升高呈负相关(r=-0.812、-0.779；-0.774、-0.781；-0.741、-0.682；-0.695、-0.594；P<0.01)。研究结论：1.从术侧肾脏外观、肾脏组织HE、Masson染色、免疫组化观察证明建模成功；2.术后7天末和3天末比较,Sham组肾间质无明显纤维化,血浆及肾脏组织miR-29c无明显改变；UUO组RIF明显增加,miR-29c明显降低,并与组织E-cadherin的降低呈正相关,与组织Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的升高呈负相关,由此推断血浆中miR-29c可能是通过TGF-β1/Smad3信号传导通路的调节参与RIF的发生和发展,有望成为RIF无创性血液学诊断标志；3.TGF-β1/Smad3信号传导通路可能是通过下调miRNA-29c参与RIF,为临床防治RIF提供理论基础和新的治疗靶点。