研究内容:1、基于公共数据库对Musashi2、TGF-β信号通路在结直肠癌中的生物信息学分析;2、探讨Musashi2在TGF-β/Smad2/3信号通路诱导EMT和结直肠癌转移过程中的作用;3、探讨Musashi2与CDC42的相互作用和调控机制。第1章基于公共数据库对Musashi2、TGF-β信号通路在结直肠癌中的生物信息学分析目的:RNA结合蛋白Musashi2在诸多癌症中明显高表达,调控癌症干细胞生物学功能,并作为预后相关基因导致患者不良预后。TGF-β信号通路参与癌症转移、侵袭及EMT等进程,并介导肿瘤细胞的化疗耐药。从公共数据库中获得结直肠癌中Musashi2及TGF-β信号通路相关生物信息数据,探讨Musashi2和TGF-β信号通路在结直肠癌中的作用,为后续研究提供理论支持。方法:于多种公共数据库中获得结直肠癌中Musashi2、EMT和TGF-β通路相关的临床数据、基因表达相关数据,并进行相应的整理。通过在线公共数据库TIMER、GEPIA及R软件等对整理后的数据进行分析,阐明Musashi2和TGF-β信号通路相关标志物在肿瘤中的差异表达情况及相关性、对EMT进程及预后的影响。分组比较联合配对比较分析Musashi2、EMT相关标志物和TGF-β信号通路相关标志物在结直肠癌中的差异表达情况。分析目的基因与临床病理资料的关系,绘制ROC曲线并进行单因素及多因素分析,通过COX回归分析及Log-rank test检验分析基因与预后关系并绘制生存曲线。建立目的基因相关的预后模型及进行Musashi2相关的单基因差异分析,将得到的结果进行富集分析与可视化处理。对Musashi2在结直肠癌免疫微环境中的作用进行免疫浸润相关分析,分析其与免疫细胞、免疫功能、免疫检查点等的关系。全面揭示Musashi2介导TGF-β诱导的EMT和结直肠癌免疫浸润中的关键靶标基因和效应通路,丰富对EMT和TGF-β-Musashi2调控网络的认识。结果:相对于对应的正常癌旁组织,Musashi2在结直肠癌中高表达,并导致患者不良预后的发生。TGF-β在结直肠癌中高表达,对于患者预后的影响体现在导致患者总体生存率下降。在结直肠癌中,TGF-β与Musashi2呈正相关关系。基于Musashi2表达情况的阳性富集信号通路的富集分析和基于TGF-β表达情况的Musashi2相关基因集的分析结果显示Musashi2和TGF-β/Smad2/3信号通路呈现正相关关系。结直肠癌中Musashi2和TGF-β/Smad2/3信号通路等与肿瘤EMT相关标志物关系紧密。Musashi2在结直肠癌相关的肿瘤免疫微环境中,与多种免疫细胞、功能等密切相关。结论:Musashi2在结直肠癌中明显高表达,与EMT、TGF-β/Smad2/3信号通路等密切正相关,可作为预后相关标志物;TGF-β/Smad2/3信号通路可能调控Musashi2的表达并介导其参与结直肠癌EMT的进程。第2章探讨Musashi2在TGF-β/Smad2/3通路诱导的EMT和结直肠癌转移中的作用目的:探讨RNA结合蛋白Musashi2在TGF-β/Smad2/3信号通路诱导的结直肠癌上皮细胞间质转化过程中的作用,以及经TGF-β/Smad2/3信号通路诱导后对结直肠癌增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。方法:获取临床结直肠癌术后的新鲜癌与对应的癌旁组织标本,免疫组化、组织免疫荧光检测Musashi2在组织中的表达情况。免疫荧光检测Musashi2在细胞里的定位及半定量表达。构建TGF-β/Smad2/3信号通路诱导的结直肠癌细胞EMT模型,分别加入TGF-β/Smad2/3通路激动剂（TGF-β1）和/或抑制剂（ITD-1）探讨TGF-β是否通过激活Smad2/3经典信号通路上调Musashi2基因表达。Western blot和q RT-PCR实验在蛋白水平及m RNA水平检测Musashi2、TGF-β在结直肠癌细胞系中的基础表达情况。Western blot检测经TGF-β1、ITD-1处理后细胞Musashi2、TGF-β/Smad2/3信号通路及EMT相关标志物表达的变化;外源性干预Smad2/3基因的表达,检测Musashi2的变化。外源性上调结直肠癌SW480细胞及下调HCT116细胞Musashi2基因的表达,构建稳定上调和下调Musashi2基因表达的体外细胞模型,采用Western blot和q RT-PCR予以效率验证及筛选。此外,对于稳定上调Musashi2的SW480细胞予以TGF-β/Smad2/3信号通路抑制剂ITD-1处理,而对于稳定下调Musashi2的HCT116细胞予以该信号通路激动剂TGF-β1处理。通过CCK8、划痕、鬼笔环肽、克隆形成实验、Transwell、结晶紫染色和Ed U实验,检测外源性干预Musashi2的表达对SW480和HCT116细胞体外增殖、细胞形态变化、迁移和侵袭能力的影响,以及Musashi2对于结直肠癌的生物学特征的影响是否可被TGF-β/Smad2/3信号通路激动剂或者抑制剂所回复。通过鬼笔环肽染色、q RT-PCR、免疫荧光和Western blot等,检测Musashi2被外源性干预表达及给药后对结直肠癌SW480细胞的细胞骨架重构、凋亡相关标志物表达变化和EMT进程的影响。将外源性干预Musashi2的结直肠癌细胞经皮下注射种植于雌性免疫缺陷裸鼠,体内动物实验检测Musashi2对结直肠癌细胞致瘤性的影响。IHC联合IF检测裸鼠皮下成瘤后,取下来的肿瘤中Musashi2、E-cadherin、Ki-67、BAX、Vimentin的表达情况,从体外动物实验水平验证Musashi2对于结直肠癌增殖、EMT进程的影响。结果:Musashi2高表达于结直肠癌组织,并在HCT116细胞中高表达,而在SW480细胞中相对低表达。TGF-β1上调Musashi2和TGF-β/Smad2/3信号通路相关基因的表达,相反,ITD-1则抑制其表达。干预Smad2/3表达后,Musashi2表达受到抑制。下调Musashi2后,凋亡标志物BAX和上皮相关标志物E-cadherin的表达增加,而Bcl-2和间质相关标志物N-cadherin、Snail、Vimentin表达受到抑制,这种作用能够被TGF-β1以逆转;上调Musashi2后,BAX、E-cadherin的表达下降,而N-cadherin、Snail、Bcl-2、Vimentin表达增加,ITD-1能逆转此种调控作用。SW480细胞经过表达Musashi2、TGF-β1处理后导致的结直肠癌细胞形态学变化,细胞形态学上出现细长、丝状伪足、间隙增宽等EMT改变。TGF-β1促进结直肠癌细胞增值、迁移能力,而ITD-1则发挥抑制作用;下调Musashi2抑制结直肠癌细胞增值、迁移及侵袭能力,而这种抑制效果可以被TGF-β1逆转;上调Musashi2刺激结直肠癌细胞增值、迁移及侵袭能力,而这种刺激效果可以被ITD-1逆转。裸鼠体外成瘤中,下调Musashi2的表达,抑制肿瘤生长,并导致瘤体中BAX、E-cadherin表达增加,而Musashi2、N-cadherin、Snail、Bcl-2、Vimentin表达减少。结论:TGF-β与结直肠癌EMT过程密切相关,其可通过经典的Smad2/3信号通路诱导结直肠癌发生EMT,导致不良预后。Musashi2作为重要分子,和TGF-β呈正相关关系,其表达受到TGF-β/Smad2/3信号通路的调控,TGF-β/Smad2/3信号通路可能通过调控Musashi2的表达来调节结直肠癌增殖、转移、凋亡及EMT。Musashi2参与调控结直肠癌细胞增殖、迁移、凋亡、侵袭及EMT进程,而这个过程受到TGF-β/Smad2/3信号通路调控。第3章探讨Musashi2与CDC42的相互作用和调控机制目的:探讨Musashi2与CDC42的相互作用和调控机制以及对结直肠癌体内外增殖、侵袭、迁移等生物学行为的作用。方法:生物信息学分析CDC42在结直肠癌中的差异表达、与患者预后的相关性及与Musashi2、EMT、TGF-β通路相关性。收集临床病例的样本和资料,IHC联合IF检测结直肠癌组织标本中CDC42蛋白的表达,分析结直肠癌组织标本中Musashi2和CDC42表达的相关性。Western blot联合PCR检测结直肠癌细胞中CDC42的基础表达情况、经外源性下调后的表达验证与筛选以及外源性干预Musashi2表达后CDC42的表达情况。Western blot检测下调CDC42的表达对EMT及凋亡相关蛋白的影响和对Musashi2上调所导致的相关基因表达变化后的作用。IF检测CDC42在细胞内和组织中的表达定位情况、与Musashi2的共定位关系以及下调Musashi2的表达对二者的影响。划痕、平板克隆、CCK8、Transwell、Ed U等实验检测外源性下调CDC42表达后,细胞增殖、迁移的变化。在构建好的稳定上调Musashi2的SW480体外细胞模型中进一步敲降CDC42基因表达,通过Rescue实验证实CDC42是Musashi2影响结直肠癌迁移、侵袭和转移能力的主要调控分子。通过划痕实验、平板克隆实验、CCK8、Transwell、Ed U实验,检测外源性上调Musashi2的结直肠癌SW480细胞经干扰CDC42表达后对EMT和结直肠癌增殖、侵袭、凋亡及转移能力的影响。通过RNA免疫共沉淀、m RNA衰减联合双荧光素酶实验,阐明Musashi2转录后调控CDC42的分子机制和作用位点。检测外源性干预CDC42的表达后,体外实验将对应的细胞接种于4周年龄的裸鼠皮下,适时予以观察及测量。IHC、IF检测外源性干预Musashi2、CDC42基因表达后,裸鼠皮下成瘤后肿瘤中CDC42、Ki-67、E-cadherin、Vimentin和BAX的表达情况。结果:Musashi2和CDC42高表达于结直肠癌组织,且Musashi2和CDC42之间呈现正相关关系。下调CDC42的表达能够促进E-cadherin、BAX的表达,而抑制N-cadherin、Snail、Bcl-2、Vimentin的表达,并且能够降低Musashi2上调对上述基因表达的调控作用。Western blot等实验结果表明Musashi2过表达能够上调CDC42的表达,这种上调作用能够被抑制CDC42表达所回复。CCK8、Ed U及平板克隆实验结果表明下调CDC42的表达能够抑制结直肠癌细胞增殖,且能降低Musashi2的上调对细胞增殖活性的促进作用。Transwell及划痕研究结果提示下调CDC42的表达可抑制细胞迁移与侵袭,并能降低Musashi2过表达对细胞迁移和侵袭能力的促进作用。利用RIP试剂盒及相应的抗体结合Musashi2后,Musashi2作为RNA结合蛋白,能够和CDC42的m RNA结合,且外源性干预下调Musashi2蛋白的表达后,CDC42的m RNA表达也随之下降。m RNA衰减实验结果表明,经放线菌素D处理后,相对于阴性对照组而言,Musashi2下调组CDC42的m RNA的合成受到抑制,随着时间推移,CDC42的m RNA越来越少,表明Musashi2作为RNA结合蛋白,调控CDC42的m RNA的稳定性。双荧光素酶实验结果表明,RNA结合蛋白Musashi2能够和CDC42的3’UTR结合,并向上积极调控其表达。下调Musashi2、CDC42的表达后,肿瘤细胞体外成瘤进程受到明显抑制,组织IHC联合IF结果提示CDC42、Ki-67、Vimentin的表达降低,而E-cadherin、BAX表达增加。进一步从体外实验角度验证CDC42对结直肠癌肿瘤增殖能力的影响,促进肿瘤增殖生长,且受到Musashi2的调控。结论:Musashi2作为RNA结合蛋白,能够和CDC42的m RNA的3’UTR结合,促进其稳定性,调控其表达,参与结直肠癌增殖、EMT及转移等生物学进程,CDC42是Musashi2影响结直肠癌增殖、侵袭和转移能力的主要调控分子。