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目的:通过恩格列净(Empagliflozin,EMPA)干预高脂饮食(High fat diet,HFD)联合链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建的糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)模型小鼠,从肠道菌群视角,探讨EMPA改善DN的作用及机制;并在DN模型基础上,使用广谱抗生素(Antibiotics,ABX)构建伪无菌小鼠模型,观察在肠道菌群耗竭的状态下,EMPA是否依然可以有效发挥原有效应,证实肠道菌群在EMPA改善DN中的关键作用,以期为EMPA治疗DN的机制研究提供新的研究方向和治疗靶点。方法:1.采用HFD联合STZ构建DN模型。按照简单随机法将C57BL/6J小鼠分为3组:正常对照组(正常饮食组(Normal food diet,NFD))、DN模型组(HFD/STZ)、EMPA治疗组(HFD/STZ+EMPA),每组6只。NFD组小鼠给予10%脂肪对照饲料,而HFD/STZ组和HFD/STZ+EMPA组小鼠给予60%脂肪高脂饲料直到第13周处死。在第4周时,采用连续5日腹腔注射STZ(50 mg·kg-1·d-1)构建DN模型。在第6周时,小鼠经前一日夜间禁食12 h,测定空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)。从第9周开始,HFD/STZ+EMPA组小鼠给予EMPA(10 mg/kg)灌胃,NFD组和HFD/STZ组小鼠给予等体积无菌水灌胃,每日1次,连续4周。在0-13周,每周称量体重。在处死小鼠前2日,对各组小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT),并连续2日收集新鲜粪便进行16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S r RNA)V3-V4区测序,并通过气相色谱-质谱(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法测定短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)以及通过酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。在处死小鼠前1日,收集尿液测定白蛋白肌酐比值(Albumin creatinine ratio,ACR)。处死小鼠前,收集血液,通过ELISA法测定血清LPS。在处死小鼠后,收集肾脏和结肠组织,通过对肾组织进行过碘酸希夫(Periodic acid schiff,PAS)染色和马松(Masson,Masson)染色以及对结肠组织进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、阿利新蓝过碘酸希夫(Alcian blue periodic acid schiff,AB-PAS)染色和免疫荧光染色观察病理形态学改变。2.在构建DN模型的基础上,使用广谱ABX构建伪无菌小鼠模型。按照简单随机法将C57BL/6J小鼠分为4组:HFD/STZ组、HFD/STZ+ABX组、HFD/STZ+EMPA组、HFD/STZ+ABX+EMPA组,每组5只。所有小鼠均给予60%脂肪高脂饲料直到第13周处死。在第4周时,采用连续5日腹腔注射STZ(50mg·kg-1·d-1)构建DN模型。在第6周时,小鼠经前一日夜间禁食12 h,测定FBG。从第8周开始,HFD/STZ+ABX组和HFD/STZ+ABX+EMPA组小鼠给予广谱ABX(甲硝唑0.5 mg/m L、多粘菌素B 1 mg/m L、万古霉素0.25 mg/m L、氨苄青霉素0.5 mg/m L)灌胃,HFD/STZ组和HFD/STZ+EMPA组给予等体积无菌水灌胃,每日1次,连续5周。从第9周开始,HFD/STZ+EMPA组和HFD/STZ+ABX+EMPA组小鼠给予EMPA(10 mg/kg)灌胃,HFD/STZ组和HFD/STZ+ABX组小鼠给予等体积无菌水灌胃,每日1次,连续4周。在处死小鼠前2日,连续2日收集新鲜粪便,通过GC-MS法测定SCFAs。在处死小鼠前1日,收集尿液测定ACR。处死小鼠后,收集肾脏和结肠组织,通过对肾组织进行PAS染色和Masson染色以及对结肠组织进行AB-PAS染色和免疫荧光染色观察病理形态学改变。结果:1.DN模型构建成功。在第6周时,HFD/STZ组和HFD/STZ+EMPA组小鼠FBG>11.1 mmol/L。在第13周时,与NFD组相比,HFD/STZ组小鼠体重显著减轻(P<0.01),OGTT不同时间点血糖及120 min内血糖曲线下面积(Area under curve,AUC)分别显著升高(P<0.01,P<0.0001),尿白蛋白肌酐比值(Urine albumin creatinine ratio,UACR)显著增加(P<0.0001),PAS染色和Masson染色显示糖尿病肾脏病理改变,肾小球和肾小管结构破坏,肾组织糖原沉积和纤维化。2.EMPA改善DN。在第13周时,与HFD/STZ组相比,HFD/STZ+EMPA组小鼠体重显著增加(P<0.01),OGTT不同时间点血糖及120 min内血糖AUC分别显著下降(P<0.01,P<0.0001),UACR显著减少(P<0.001),肾小球和肾小管结构大致恢复正常,肾组织糖原沉积和纤维化明显减少。3.EMPA调节肠道菌群及代谢。EMPA增加肠道菌群多样性,促进产SCFAs的Bacteroides和Odoribacter,抑制产LPS的Oscillibacter。Tax4Fun功能预测分析显示,HFD/STZ组小鼠肠道菌群主要富集在分泌系统,ABC转运蛋白,甲烷代谢,细菌运动蛋白,双组分系统,群体感应。HFD/STZ+EMPA组小鼠肠道菌群主要富集在嘌呤代谢,信使RNA生物合成,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,外泌体,氨基酸相关酶,线粒体生物合成,并且分泌系统,ABC转运蛋白,双组分系统,群体感应途径下调。EMPA分别显著增加粪便总SCFAs、乙酸、丁酸(P<0.01,P<0.01,P<0.05),丙酸、戊酸、异丁酸和异戊酸分别呈增加趋势(P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05),并且EMPA显著降低粪便LPS(P<0.0001)。4.EMPA修复肠粘膜屏障损伤。与HFD/STZ组相比,HFD/STZ+EMPA组小鼠结肠隐窝结构大致恢复正常,杯状细胞数量、闭锁连接蛋白-1(Zonula occludens-1,ZO-1)表达和Occludin蛋白表达分别显著增加(P<0.001,P<0.001,P<0.01),血清LPS显著下降(P<0.01)。5.肠道菌群、SCFAs、LPS、UACR之间存在相关性。Bacteroides分别与总SCFAs、乙酸呈正相关(P<0.05,P<0.05)。Odoribacter分别与总SCFAs、丁酸呈正相关(P<0.05,P<0.05)。Oscillibacter分别与粪便LPS、血清LPS呈正相关(P<0.01,P<0.001)。UACR分别与粪便LPS、血清LPS、Oscillibacter呈正相关(P<0.001,P<0.001,P<0.01),UACR分别与总SCFAs、乙酸、丁酸呈负相关(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。6.在伪无菌DN模型小鼠中,EMPA降低UACR、肾组织糖原沉积和纤维化的作用减弱。与HFD/STZ+ABX+EMPA组相比,HFD/STZ+EMPA组小鼠UACR显著下降(P<0.05),肾组织糖原沉积显著减少(P<0.05),肾组织纤维化呈减少趋势(P>0.05)。7.在伪无菌DN模型小鼠中,EMPA增加粪便SCFAs的作用减弱。与HFD/STZ+ABX+EMPA组相比,HFD/STZ+EMPA组小鼠粪便总SCFAs、乙酸和丁酸分别显著增加(P<0.0001,P<0.0001,P<0.001)。8.在伪无菌DN模型小鼠中,EMPA增加结肠杯状细胞数量、ZO-1蛋白和Occludin蛋白表达的作用减弱。与HFD/STZ+ABX+EMPA组相比,HFD/STZ+EMPA组小鼠结肠杯状细胞数量明显增加,ZO-1蛋白表达显著增加(P<0.0001),Occludin蛋白表达呈增加趋势(P=0.0618)。结论:1.EMPA可缓解DN模型小鼠的体重减轻、葡萄糖耐量受损,改善肾脏功能,缓解肾小球和肾小管结构破坏,减少肾组织糖原沉积和纤维化,改善代谢紊乱以及肾脏功能和病理损伤,从而改善DN。2.EMPA可调节DN模型小鼠的肠道菌群及代谢,促进产SCFAs的Bacteroides和Odoribacter,抑制产LPS的Oscillibacter,增加粪便SCFAs,降低粪便LPS。3.EMPA可缓解DN模型小鼠的结肠隐窝结构破坏,增加杯状细胞数量、ZO-1蛋白和Occludin蛋白表达,修复肠粘膜屏障损伤,降低血清LPS。4.在肠道菌群耗竭的状态下,EMPA改善肾脏功能、肾组织糖原沉积和纤维化的作用减弱,不能有效发挥改善肾脏功能和病理损伤的作用。5.在肠道菌群耗竭的状态下,EMPA增加粪便SCFAs的作用减弱,不能有效发挥调节肠道菌群代谢的作用。6.在肠道菌群耗竭的状态下,EMPA增加杯状细胞数量、ZO-1蛋白和Occludin蛋白表达的作用减弱,不能有效发挥修复肠粘膜屏障损伤的作用。综上所述,EMPA通过调节肠道菌群,促进产SCFAs的Bacteroides和Odoribacter,抑制产LPS的Oscillibacter,增加粪便SCFAs,降低粪便LPS,修复肠粘膜屏障损伤,降低血清LPS,从而发挥改善DN的作用。