论文部分内容阅读
链霉菌来源的卤化天然产物往往具有很好的生物活性和成药潜力，是新抗生素的重要来源。对典型生境来源的含卤化酶基因的链霉菌进行基因资源挖掘可望获得新的活性卤化天然产物。本文以3株分别来自中国南海深海海泥、渤海浅海海泥及内陆贵州梵净山保护区土壤等环境样品的Streptomyces olivaceus FXJ7.023、Streptomyces sp.FXJ7.388和Streptomyces sp.FJS31-2卤化酶基因阳性链霉菌为主要研究对象，通过次级代谢合成及修饰基因筛选、Fosmid基因组文库构建及筛选、基因组测序及其次级代谢基因簇预测分析，结合菌株发酵产物分离及结构解析、遗传操作、核糖体工程及培养条件优化等手段，在对这3株菌进行次级代谢潜力评估的基础上，对其次级代谢产物及其对应的生物合成基因簇进行挖掘和鉴定。 本研究主要内容包括：⑴链霉菌S.olivaceus FXJ7.023的基因组大小约8.2 Mb，G+C mol％为72.46％，编码7500个开放式阅读框，包含次级代谢产物基因簇43个。该菌基因组编码2个黄素依赖型卤化酶，其中1个卤化酶位于糖肽类生物合成基因簇中，且在系统发育树上和替考拉宁等卤化糖肽类产物的合成基因簇中的卤化酶聚类在一起;另外1个卤化酶位于羊毛硫抗菌肽基因簇中，且在系统发育树上和Ⅱ型聚酮类卤化合物napyradiomycin的卤化酶聚类在一起。遗憾的是，经多种努力也未能检测到相应的卤化物。在产物挖掘的过程中，从该菌发酵产物中分离、纯化到大环乙酰乙酸内酯类抗生素家族的lobophorin A和B等Ⅰ型聚酮类化合物，进而通过基因组文库重叠筛选及测序、结构基因lob KS1的负载域敲除及发酵产物检测等，获得并鉴定了1个全长为105 kb、编码35个开放式阅读框的lobophorin生物合成基因簇。S.olivaceus FXJ7.023基因组还包含1个与天蓝色链霉菌Streptomycescoelicolor A3(2)的Ⅲ型聚酮化合物tetrahydroxynaphthalene(THN)生物合成基因簇高度同源的基因簇，但却无法获得相应产物。将该基因簇的结构基因查尔酮合成酶基因sorppA和修饰基因细胞色素氧化酶P450基因socyp158a2构建串联原核表达质粒载体并转化大肠杆菌宿主菌，发酵产物GC-MS检测结果显示，这两个基因的串联表达促进宿主菌合成了吲哚和酚，表明该基因簇处于适当环境下能够催化相应产物的生物合成。⑵链霉菌S.sp.FXJ7.388的基因组大小约6.9 Mb，G+C mol％为73.19％，编码6327个开放式阅读框，包含次级代谢产物基因簇22个，其中包括1个结构较完整的与万古霉素、替考拉宁等卤化糖肽类生物合成基因簇高度同源的卤化产物合成基因簇，遗憾的是各种激活的努力都未能获得相应的卤化物。然而，在激活该卤化产物基因簇的尝试过程中，通过核糖体工程技术“意外”的激活了该菌的吲哚倍半萜类化合物xiamycin基因簇的生物合成，获得了产物xiamycin A和B，并通过与已知的xiamycin基因簇比较分析，推断出xiamycin的可能的生物合成途径。⑶链霉菌S.sp.FJS31-2的基因组大小约11.6 Mb，G+C mol％为70.76％，编码10877个开放式阅读框，包含次级代谢产物基因簇23个，其中有2个基因组成相对完整的卤化产物合成基因簇，包括1个卤化Ⅱ型聚酮anthrabenzoxocinone(ABX)类产物生物合成基因簇和1个卤化短肽类产物生物合成基因簇。该卤化Ⅱ型聚酮基因簇的基因组成、排列及氨基酸残基序列和与课题组分离的ABXs(1.264-C，BE-24566B)产生菌Streptomyces sp.FXJ1.264基因组中唯一的1个Ⅱ型聚酮合成基因簇高度相似。通过优化培养基配方及培养条件等手段，成功地从S.sp.FJS31-2获得BE-24566B及其系列卤化修饰产物。通过敲除该基因簇的产物合成结构基因abxp、abxk和abxs，获得无ABXs系列化合物产生的突变株，说明该基因簇参与了BE-24566B系列化合物的合成。同时，从该菌株中获得了卤化短肽类系列卤化物。