论文部分内容阅读
中心体作为动物细胞一种重要的细胞器及主要的微管组织中心,其在细胞中的数目较稳定:间期一个分裂期两个。中心体在细胞间期和分裂期担负的作用不同:细胞间期中心体对于维持细胞的极性、细胞形态及细胞的运动至关重要;分裂期主要参与分裂极的形成以保证遗传物质准确分配到子代细胞中。中心体畸变尤其中心体数目扩增(中心体扩增)对细胞正常生命活动影响巨大,往往会导致细胞分裂无法正常进行,进而导致染色体无法正常分配到子代细胞引起染色体不稳定性。鉴于中心体扩增大多会导致染色体分配异常,普遍认为中心体畸变是导致肿瘤中染色体不稳定性的关键诱因。目前,已在人类的多种肿瘤(实体瘤及血癌)中均观察到中心体扩增。
细胞基因组DNA无时无刻均面临外源性或者内源性的DNA损伤,机体依靠相应的DNA损伤修复机制以维持基因组稳定性。细胞一旦受到DNA损伤,便会快速启动DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)信号通路,上调某些关键DNA修复蛋白,同时DDR会通过信号转导对周期监测点的关键蛋白进行调控(磷酸化/去磷酸化/泛素化等)以实现相应的细胞周期阻滞,避免损伤的DNA传递至子代细胞。有研究显示,正常细胞或者恶性肿瘤细胞受到DNA损伤后会导致中心体扩增。中心体作为细胞内各种信号通路的集散中心,有研究显示某些关键的DDR蛋白会定位在中心体,eg ATR,ATM,Chk1,Chk2,BRCA1,BRCA2等,尽管有些分子只是在细胞的某一周期进程中定位于中心体。这些研究结果提示DNA损伤应答与中心体有着千丝万缕的关联,两者相互影响:一方面DNA损伤会导致中心体扩增,另一方面中心体有可能参与DDR信号通路的激活。
在众多DNA损伤修复通路中,核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)作为主要的修复途径,修复的损伤DNA类型最为广泛。XPC(Xeroderma pigmentosum group C)作为NER通路最早的损伤识别蛋白,主要以XPC-HR23B复合物的形式识别DNA损伤位点,进而募集更多修复蛋白参与后续修复。近来的研究显示XPC不仅参与NER修复,其在细胞周期调控及细胞凋亡中可能起着信号转导的作用。另外,Friedberg等实验研究发现XPC基因敲除鼠在暴露于各种化学致癌物的作用下,更易发生各种不同系统与器官的(皮肤、膀胱、肝脏、肺等肿瘤)实体恶性肿瘤。但是XPC的缺失如何导致染色体不稳定性进而导致肿瘤的发生这一具体机制目前尚不可知。
膀胱肿瘤在中国男性泌尿生殖系统肿瘤中发病率第一,远高于西方国家。近年研究发现其发病率有逐年上升且年轻化的趋势。膀胱肿瘤具有高异质性、易复发及耐药等生物学行为。肿瘤遗传学的研究发现膀胱癌脱落细胞染色体存在大量不同位点的杂合性缺失(loss of heterogeneity,LOH)、异倍体等染色体畸变。临床研究显示膀胱肿瘤在包括顺铂等化疗后一旦复发,肿瘤的恶性程度常明显增强,伴随更严重的染色体畸变,目前就何种机制导致此现象尚不清楚。前期工作发现膀胱癌中XPC普遍低表达,并且和膀胱癌的分级分期密切相关。同时,膀胱癌XPC低表达和肿瘤脱落细胞的染色体畸变密切相关,提示XPC表达缺失可能是膀胱癌染色体畸变和高异质性的重要遗传学基础。结合肿瘤生物学的发现:中心体扩增是肿瘤染色体畸变及异倍体发生的显著特征及重要早期事件。推测XPC有可能通过调控中心体扩增影响膀胱癌中异倍体、杂合性缺失等染色体畸变的发生进而参与膀胱癌的发生发展甚至复发。
目的:
本课题旨在探究膀胱癌XPC低表达与中心体扩增的关联并研究其分子机制。本课题主要对XPC通过何种机制导致中心体扩增进行了深入的研究,期望在回答此问题的同时发现XPC在DNA损伤应答信号转导中的新功能、新角色,为更全面的理解XPC在DNA损伤应答及膀胱癌复发、预后诊断提供更有价值的信息。
方法和结果:
1.膀胱癌XPC低表达导致中心体扩增。本部分通过免疫组化及免疫荧光实验发现膀胱癌组织XPC表达与中心体扩增具有明显负相关性;随后在XPC转基因小鼠及膀胱癌细胞系中均观察到XPC低表达导致中心体扩增和分裂畸变,且XPC低表达导致的中心体扩增不依赖其NER经典角色。
2.膀胱癌XPC低表达导致的中心体扩增不依赖centrin2细胞定位的改变。接下来,研究了XPC低表达导致中心体扩增的具体机制。有研究显示XPC可介导centrin2由胞浆向胞核内募集,从而阻碍中心体组装进而调控中心体扩增。所以本部分首先通过免疫荧光的方法观察了膀胱癌细胞顺铂损伤前后centrin2定位有无改变,结果发现膀胱癌细胞在顺铂损伤前后其centrin2细胞定位无明显改变。另外,采用不能结合centrin2的XPC突变体依然能回补XPC低表达导致的中心体扩增表型,提示XPC通过改变centrin2定位阻碍中心体扩增的机制在膀胱癌细胞中并不存在或者不发挥主导作用。
3.XPC低表达导致ATM-Chk1/Chk2信号通路持续激活,导致G2/M周期阻滞延长。进一步探究了XPC低表达导致中心体扩增的具体机制。由于异常的周期阻滞可能会开启中心体复制的相关信号导致中心体扩增,本部分通过流式细胞术观察了干扰XPC后细胞周期的改变,结果显示干扰XPC导致G2/M周期阻滞延长,Western blot(WB)检测DNA损伤应答通路的关键分子显示,干扰XPC后,导致ATM-Chk1/Chk2信号通路持续激活进而导致G2/M周期阻滞延长。同时证实XPC低表达导致的中心体扩增依赖于ATM-Chk1/Chk2的持续激活。
4.XPC低表达导致双链损伤(double strand break,DSB)的关键修复蛋白BRCA1/Rad51表达下调及DNA双链损伤累积增多。本部分主要研究了干扰XPC后为何导致DNA损伤应答信号通路ATM-Chk1/Chk2持续活化,WB及RT-PCR结果显示:XPC低表达导致DNA双链损伤修复通路的关键蛋白BRCA1、Rad51无法诱导表达或者诱导表达明显降低,导致DNA双链损伤无法正常修复进而导致损伤的累计;同时,免疫荧光的结果显示,XPC低表达导致DNA双链损伤的标志性marker—γH2AX foci增多;进一步证实细胞内存在更多的DNA损伤等待修复,这一未修复的损伤会持续激活损伤应答通路,最终导致ATM-Chk1/Chk2信号通路的持续活化。
5.XPC通过Pit-1调控BRCA1影响DNA损伤应答及中心体扩增。本部分主要关注了XPC通过何种机制转录调控BRCA1表达,基于以往的研究报道,发现了BRCA1的转录抑制子—Pit-1。CoIP结果显示XPC与Pit-1无相互作用,WB及RT-PCR结果显示XPC低表达导致Pit-1表达上调,进一步通过Luciferase双荧光素酶报告系统发现干扰XPC后会上调Pit-1转录。进一步通过siPit-1观察DNA损伤应答信号通路ATM-Chk1/Chk2的活化状态及中心体扩增情况,结果发现siPit-1可诱导BRCA1的表达,同时DDR持续活化的状态及中心体扩增明显降低。提示XPC通过Pit-1调控BRCA1影响DNA损伤应答及中心体扩增。
结论:
通过上述的实验研究,分别从膀胱癌病理组织、XPC基因敲除鼠、膀胱癌细胞等多层面证实XPC低表达导致中心体扩增和分裂畸变,且XPC低表达导致的中心体扩增不依赖其NER经典角色。本研究提出了XPC调控中心体扩增新的分子机制:XPC低表达上调Pit-1的转录,而后者作为BRCA1的转录抑制子会下调BRCA1的表达。作为关键的DNA损伤修复蛋白,细胞中BRCA1无法正常表达将导致双链损伤无法正常修复,引起损伤的累积,这一未修复的损伤会持续激活损伤应答通路,最终导致ATM-Chk1/Chk2信号通路的持续活化引发G2/M过长的周期阻滞进而导致中心体扩增。
细胞基因组DNA无时无刻均面临外源性或者内源性的DNA损伤,机体依靠相应的DNA损伤修复机制以维持基因组稳定性。细胞一旦受到DNA损伤,便会快速启动DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)信号通路,上调某些关键DNA修复蛋白,同时DDR会通过信号转导对周期监测点的关键蛋白进行调控(磷酸化/去磷酸化/泛素化等)以实现相应的细胞周期阻滞,避免损伤的DNA传递至子代细胞。有研究显示,正常细胞或者恶性肿瘤细胞受到DNA损伤后会导致中心体扩增。中心体作为细胞内各种信号通路的集散中心,有研究显示某些关键的DDR蛋白会定位在中心体,eg ATR,ATM,Chk1,Chk2,BRCA1,BRCA2等,尽管有些分子只是在细胞的某一周期进程中定位于中心体。这些研究结果提示DNA损伤应答与中心体有着千丝万缕的关联,两者相互影响:一方面DNA损伤会导致中心体扩增,另一方面中心体有可能参与DDR信号通路的激活。
在众多DNA损伤修复通路中,核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)作为主要的修复途径,修复的损伤DNA类型最为广泛。XPC(Xeroderma pigmentosum group C)作为NER通路最早的损伤识别蛋白,主要以XPC-HR23B复合物的形式识别DNA损伤位点,进而募集更多修复蛋白参与后续修复。近来的研究显示XPC不仅参与NER修复,其在细胞周期调控及细胞凋亡中可能起着信号转导的作用。另外,Friedberg等实验研究发现XPC基因敲除鼠在暴露于各种化学致癌物的作用下,更易发生各种不同系统与器官的(皮肤、膀胱、肝脏、肺等肿瘤)实体恶性肿瘤。但是XPC的缺失如何导致染色体不稳定性进而导致肿瘤的发生这一具体机制目前尚不可知。
膀胱肿瘤在中国男性泌尿生殖系统肿瘤中发病率第一,远高于西方国家。近年研究发现其发病率有逐年上升且年轻化的趋势。膀胱肿瘤具有高异质性、易复发及耐药等生物学行为。肿瘤遗传学的研究发现膀胱癌脱落细胞染色体存在大量不同位点的杂合性缺失(loss of heterogeneity,LOH)、异倍体等染色体畸变。临床研究显示膀胱肿瘤在包括顺铂等化疗后一旦复发,肿瘤的恶性程度常明显增强,伴随更严重的染色体畸变,目前就何种机制导致此现象尚不清楚。前期工作发现膀胱癌中XPC普遍低表达,并且和膀胱癌的分级分期密切相关。同时,膀胱癌XPC低表达和肿瘤脱落细胞的染色体畸变密切相关,提示XPC表达缺失可能是膀胱癌染色体畸变和高异质性的重要遗传学基础。结合肿瘤生物学的发现:中心体扩增是肿瘤染色体畸变及异倍体发生的显著特征及重要早期事件。推测XPC有可能通过调控中心体扩增影响膀胱癌中异倍体、杂合性缺失等染色体畸变的发生进而参与膀胱癌的发生发展甚至复发。
目的:
本课题旨在探究膀胱癌XPC低表达与中心体扩增的关联并研究其分子机制。本课题主要对XPC通过何种机制导致中心体扩增进行了深入的研究,期望在回答此问题的同时发现XPC在DNA损伤应答信号转导中的新功能、新角色,为更全面的理解XPC在DNA损伤应答及膀胱癌复发、预后诊断提供更有价值的信息。
方法和结果:
1.膀胱癌XPC低表达导致中心体扩增。本部分通过免疫组化及免疫荧光实验发现膀胱癌组织XPC表达与中心体扩增具有明显负相关性;随后在XPC转基因小鼠及膀胱癌细胞系中均观察到XPC低表达导致中心体扩增和分裂畸变,且XPC低表达导致的中心体扩增不依赖其NER经典角色。
2.膀胱癌XPC低表达导致的中心体扩增不依赖centrin2细胞定位的改变。接下来,研究了XPC低表达导致中心体扩增的具体机制。有研究显示XPC可介导centrin2由胞浆向胞核内募集,从而阻碍中心体组装进而调控中心体扩增。所以本部分首先通过免疫荧光的方法观察了膀胱癌细胞顺铂损伤前后centrin2定位有无改变,结果发现膀胱癌细胞在顺铂损伤前后其centrin2细胞定位无明显改变。另外,采用不能结合centrin2的XPC突变体依然能回补XPC低表达导致的中心体扩增表型,提示XPC通过改变centrin2定位阻碍中心体扩增的机制在膀胱癌细胞中并不存在或者不发挥主导作用。
3.XPC低表达导致ATM-Chk1/Chk2信号通路持续激活,导致G2/M周期阻滞延长。进一步探究了XPC低表达导致中心体扩增的具体机制。由于异常的周期阻滞可能会开启中心体复制的相关信号导致中心体扩增,本部分通过流式细胞术观察了干扰XPC后细胞周期的改变,结果显示干扰XPC导致G2/M周期阻滞延长,Western blot(WB)检测DNA损伤应答通路的关键分子显示,干扰XPC后,导致ATM-Chk1/Chk2信号通路持续激活进而导致G2/M周期阻滞延长。同时证实XPC低表达导致的中心体扩增依赖于ATM-Chk1/Chk2的持续激活。
4.XPC低表达导致双链损伤(double strand break,DSB)的关键修复蛋白BRCA1/Rad51表达下调及DNA双链损伤累积增多。本部分主要研究了干扰XPC后为何导致DNA损伤应答信号通路ATM-Chk1/Chk2持续活化,WB及RT-PCR结果显示:XPC低表达导致DNA双链损伤修复通路的关键蛋白BRCA1、Rad51无法诱导表达或者诱导表达明显降低,导致DNA双链损伤无法正常修复进而导致损伤的累计;同时,免疫荧光的结果显示,XPC低表达导致DNA双链损伤的标志性marker—γH2AX foci增多;进一步证实细胞内存在更多的DNA损伤等待修复,这一未修复的损伤会持续激活损伤应答通路,最终导致ATM-Chk1/Chk2信号通路的持续活化。
5.XPC通过Pit-1调控BRCA1影响DNA损伤应答及中心体扩增。本部分主要关注了XPC通过何种机制转录调控BRCA1表达,基于以往的研究报道,发现了BRCA1的转录抑制子—Pit-1。CoIP结果显示XPC与Pit-1无相互作用,WB及RT-PCR结果显示XPC低表达导致Pit-1表达上调,进一步通过Luciferase双荧光素酶报告系统发现干扰XPC后会上调Pit-1转录。进一步通过siPit-1观察DNA损伤应答信号通路ATM-Chk1/Chk2的活化状态及中心体扩增情况,结果发现siPit-1可诱导BRCA1的表达,同时DDR持续活化的状态及中心体扩增明显降低。提示XPC通过Pit-1调控BRCA1影响DNA损伤应答及中心体扩增。
结论:
通过上述的实验研究,分别从膀胱癌病理组织、XPC基因敲除鼠、膀胱癌细胞等多层面证实XPC低表达导致中心体扩增和分裂畸变,且XPC低表达导致的中心体扩增不依赖其NER经典角色。本研究提出了XPC调控中心体扩增新的分子机制:XPC低表达上调Pit-1的转录,而后者作为BRCA1的转录抑制子会下调BRCA1的表达。作为关键的DNA损伤修复蛋白,细胞中BRCA1无法正常表达将导致双链损伤无法正常修复,引起损伤的累积,这一未修复的损伤会持续激活损伤应答通路,最终导致ATM-Chk1/Chk2信号通路的持续活化引发G2/M过长的周期阻滞进而导致中心体扩增。