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目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病(diabetes mellitus,DM)常见微血管并发症,是导致终末期肾脏病(ESRD)的主要原因之一。在过去几十年,DN发病率在全球范围内呈逐年递增的趋势,已成为糖尿病患者致残、致死的主要原因之一。DN发病机制复杂,近来研究已证实炎性反应在DN发生发展中发挥着不可小觑的作用。多种炎症信号通路介导DN发生发展,其中TLR4及其下游NF-κB信号通路参与包括炎性反应、固有免疫等多种生物效应过程。高糖、糖基化终末产物等刺激可以激活TLR4,继而进一步激活下游NF-κB等炎症通路,诱导炎症因子表达,最终导致炎症反应的发生。因此抑制炎症信号通路可延缓DN进展。miRNA是的从稳定发夹状的二级结构通过一系列酶切而来的长度约21-25个核苷酸,属于高度保守的非编码单链小RNA分子。它具有重要调节转录和转录后基因表达的功能,参与了真核生物的一系列病理生理过程。近年来研究表明miRNA与DN的发生发展之间存在密切的联系,并且可以通过抑制炎症相关细胞因子的表达来改善DN的进展,但其具体机制不详。雷公藤甲素是从雷公藤中提取出来的主要的活性成分,具有抗炎、抗免疫的作用。雷公藤甲素的抗炎、抗免疫作用主要是通过作用于T淋巴细胞、树突状细胞等多种免疫细胞,和抑制炎性细胞因子表达、黏附和趋化因子分泌来实现的。实验研究证实雷公藤甲素能够有效降低蛋白尿,改善足细胞足突融合,减轻肾小球肥大从而改善DN肾脏损伤。但是雷公藤甲素对于糖尿病肾小管间质病变作用及其机制的研究相对较少。最近一些研究表明雷公藤甲素可以通过调控miRNA发挥药理作用。雷公藤甲素和miRNA在DN炎症反应之间是否存在关联,是我们需要探讨的问题。本实验旨在研究雷公藤甲素是否可以通过miRNA减轻DN的炎症反应从而延缓DN进展。方法大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞株)置于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,于5%CO2,37℃培养箱中培养。每2-3天更换培养液,培养至80%融合,以0.25%胰蛋白酶消化,传代或用于实验。取对数生长期NRK-52E细胞,以1×105/ml密度接种于6孔无菌细胞培养板进行实验,每次干预前将各组培养基换为无血清含0.2%BSA的低糖培养基对细胞进行饥饿,以保证细胞同步化。(1)将NRK-52E细胞分为NG组(DMEM低糖培养基,含葡萄糖5.5mmol/L)、MA组(DMEM低糖培养基,含甘露醇19.5 mmol/L)、HG组(DMEM高糖培养基,含葡萄糖25mmol/L)、HG+TP组(HG+雷公藤甲素5ng/ml),各组细胞在DMEM培养基中培养24h,采用qRT-PCR及Western-blot分别从基因水平、蛋白水平检测NRK-52E细胞中炎症因子TLR4、NF-κB、TGF-β1、ICAM-1的表达;用miRNA芯片筛查三组之间有差异性表达的miRNA并用qRT-PCR来验证。(2)向高糖培养的NRK-52E细胞中转染miR-224-3p mimics及mimics NC分为NG组、HG组、HG+miR-NC组(HG+mimics NC)、HG+miR-224-3pm组(HG+miR-224-3p mimics),转染48h收集细胞,qRT-PCR及Western-blot检测TLR4、NF-κB、TGF-β1、ICAM-1 m RNA和蛋白的表达。(3)向293T细胞共转染重组构建的含TLR4 m RNA 3’UTR区的荧光素酶报告基因质粒和miR-224-3p mimics,应用双荧光素酶活性检测验证TLR4 m RNA的3’UTR与miR-224-3p有无直接结合。(4)向雷公藤甲素干预的高糖培养NRK-52E细胞中转染miR-224-3p的inhibitor及inhibitor NC,分为NG组、HG组、HG+TP组、HG+TP+miR-i NC组(HG+雷公藤甲素+inhibitor NC)、HG+TP+miR-224-3pi组(HG+雷公藤甲素+miR-224-3p inhibitor)转染24h后加入雷公藤甲素,转染后共培养48h收集细胞,qRT-PCR及Western-blot检测TLR4、NF-κB、TGF-β1、ICAM-1m RNA和蛋白的表达。结果(1)NRK-52E细胞培养24h后,qRT-PCR及Western-blot结果显示与NG组比较HG组TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表达均显著增加(P<0.05),与HG组比较HG+TP组TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表达均显著减少(P<0.05)。miRNA芯片分析提示miR-224-3p在高糖组表达明显下调(P<0.05),而在HG+TP组明显上调(P<0.05)。随后我们增加样本量利用qRT-PCR验证每组mir-224-3p表达差异。结果与miRNA芯片分析一致。(2)向高糖培养的NRK-52E细胞中转染miR-224-3p mimics后培养48h,RT-PCR及Western-blot结果显示与NG组相比HG组TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表达均显著增加(P<0.05),与HG组相比HG+miR-224-3pm组TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。(3)荧光素酶报告基因检测结果显示:miR-224-3p能够显著的抑制TLR4 3’-非编码(3’-UTR)区荧光素酶活性(P<0.01),但是对突变的TLR4-3’UTR荧光素酶活性没有影响。(4)向HG+TP组细胞中转染miR-224-3p inhibitor,RT-PCR及Western-Blotting结果显示与HG组相比HG+TP组TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表达显著降低(P<0.05),与HG+TP相比HG+TP+miR-224-3pi组TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA表达显著上调(P<0.05)。结论(1)雷公藤甲素降低肾小管上皮细胞TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1表达,减轻高糖诱导的NRK-52E细胞的炎症反应。(2)miR-224-3p能与TLR4 3’UTR区结合抑制TLR4表达。雷公藤甲素通过上调miR-224-3p的表达抑制TLR4表达改善高糖诱导的NRK-52E细胞的炎症反应,而下调miR-224-3p的表达能够减弱雷公藤甲素的抗炎作用。