经瞳孔温热疗法(transpupillary thermotherapy，TTT)是近年来用于治疗脉络膜新生血管的一种激光疗法。该治疗方法的特点是采用低能量、大光斑、长时间照射，使局部组织低升温，来达到使脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)消退，又不对周围组织造成损伤的目的。但目前对于TTT治疗的机理却了解甚少。许多学者曾对TTT照射后的组织进行病理学研究，发现组织内存在热休克蛋白高表达、细胞凋亡等现象，推测其可能的机理是组织低升温，使CNV血管内皮细胞凋亡，同时低升温促使热休克蛋白高表达，减少了热能对周围组织的损伤。 本文前两部分通过对正常大鼠视网膜或体外培养的血管内皮细胞行较高能量半导体激光(diode laser，DL)照射前，先予一次低能量DL预照射，探讨DL预照射对受照射组织热休克蛋白表达的影响以及对视网膜和血管内皮细胞可能产生的作用。第三部分建立非激光诱导的色素兔CNV模型，为今后进一步探讨TTT治疗的安全性及有效性提供实验平台。 第一部分：DL预照射对视网膜保护作用的探讨 目的：低能量DL预照射大鼠视网膜20小时后再进行较高能量DL照射，探讨DL预照射是否对视网膜神经上皮层存在保护效应，并讨论该过程中视网膜Hsp70高表达的相关性。 对象与方法：26只挪威棕色大鼠按照随机原则分为5组。A组：DL低能量(60 mW)预照射视网膜20小时后予第二次DL高能量(80 mW)照射，12小时后观察。B组：未予低能量DL预照射，直接行高能量照射，12小时后观察。C组：只予DL低能量照射，36小时后观察。D组：除未行DL照射外，其余操作均同A、B、C组。E组：空白对照。所有各组的观察指标均为：眼底检查、FFA、ICGA检查，以及病理学检查，并通过免疫组化、原位杂交以及Western B10t蛋白质半定量法检测视网膜Hsp70表达；以TUNEL法原位检测视网膜组织内凋亡，免疫组化法与Western B10t蛋白质半定量法检测视网膜活性Caspase 3表达。 结果：各组大鼠眼底检查均无异常，FFA检查可见B组少量光斑存在荧光素渗漏，ICGA未见荧光染料积存。各组视网膜切片HE染色也未见组织结构改变，光镜、电镜下均未见组织坏死。免疫组化法检测结果显示：各组视网膜Hsp70表达阳性，以内、外丛状层为主，DL照射组显著高于对照组，其中A组视网膜Hsp70表达明显高于B组、C组。Westerrl Blot结果与此一致。原位杂交法检测结果视网膜内、外丛状层Hsp70 mRNA阳性表达。TUNEL结果示DL照射后视网膜内、外核层(INL、ONL)均可见不同程度细胞凋亡，并且外核层更多见，其中B组INL、ONL细胞凋亡率明显高于A组和C组，D、E两对照组未见明显凋亡。DL照射后视网膜神经上皮层活性Caspase 3免疫表达阳性，Wrestem B1Ot结果示B组视网膜活性Caspase 3表达明显高于A组和C组，对照组表达不明显。 结论：DL照射眼底虽无肉眼可见视网膜损害，但视网膜INL、ONL存在细胞凋亡。高能量(80 mW)DL照射前先予低能量(60 mW)DL预照射，能够减轻高能量DL照射引起的视网膜细胞凋亡。这一保护效应可能与低能量DL诱导视网膜神经细胞自身保护性蛋白—Hsp70高表达，从而提高视网膜对热的耐受能力有关。提示临床对患者进行TTT治疗前1天先予一次低能量DL预照射，有可能减轻TTT治疗对视网膜的损害。 第二部分：DL预照射对血管内皮细胞的影响 目的：探讨在高能量DL照射血管内皮细胞前先予一次低能量DL预照射对体外培养的血管内皮细胞的影响，以及Hsp70高表达在此过程中可能产生的作用。 对象与方法：体外培养人脐静脉血管内皮细胞(ECV 304)。细胞内加入ICG 15μg／ml后，分组予不同方式DL照射。A组：低能量(500 mW)DL预照射后20小时再行第二次高能量(900 mW)DL照射，12小时后观察。B组：未予低能量DL预照射，直接予高能量DL照射后12小时进行观察。C组：只予低能量DL照射后36小时观察。D组：除不予DL照射外，其余操作均同A、B、C组。E组：空白对照。所有各组细胞的观察指标如下：光镜、电镜下观察各组细胞结构形态。免疫细胞化学法检测细胞内Hsp70表达。并收集细胞抽提总蛋白，Wrestem B1ot蛋白质半定量检测Hsp70在细胞内的含量。同时行流式细胞仪检测细胞存活率、凋亡率与坏死率。免疫细胞化学法及Westem Blot法检测细胞内活性Caspase 3的含量。结果：流式细胞仪检测结果B组细胞坏死率(47.21％)明显多于A组 (21.45％)和C组(1.49％)，B组细胞凋亡率(18.34％)显著少于A组 (41.22％)，C组凋亡率(7.20％)与正常对照相近。D、E组凋亡、坏死均不明显(凋亡率分别为5.14％、2.98％，坏死率分别为1.55％、O.96％)。免疫细胞化学法检测示胞浆内活性Caspase 3表达阳性。Westem B10t法结果示活性Caspase 3含量：B组明显低于A组。免疫细胞化学实验结果不：DL照射组细胞胞浆内Hsp70强阳性，其中A组明显高于B组，对照组细胞胞浆内Hsp70弱阳性。Western Blot结果示：Hsp70表达可见于所有细胞，但DL照射组明显高于对照组，且A组明显高于B组。 结论：低能量(500 roW)DL预照射后再予高能量(900 mW)DL照射体外培养的血管内皮细胞，能够显著减少细胞坏死，从而减少细胞内炎性介质释放导致的局部炎性反应。该效应可能与低能量DL诱导细胞内Hsp70高表达，抗细胞坏死作用有关。提示：临床采用TTT治疗CNV前l天，先予一次低能量DL预照射，有可能减轻TTT治疗时引发的局部炎性反应，从而减少CNV再形成的可能。 第三部分：碱性成纤维细胞生长因子诱导色素兔脉络膜新生血管形成 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导青紫兰色素兔脉络膜新生血管模型的方法及可行性，尝试建立脉络膜新生血管的非激光诱导模型。 方法：健康成年青紫兰色素兔40只，随机分为二组。A组为实验组，视网膜下注入0.005％(wt/v01)bFGF 50μl，B组为对照组，视网膜下注入0.9％生理盐水50μl，对侧眼都作空白对照，不行视网膜下注射。视网膜注射后3天，1、2、3、4、6、8、12周分别行眼底检查、FFA、ICGA，并行眼球组织病理学检查。 结果：视网膜下注射后所有眼均即见视网膜直径4-5PD青灰色半球形隆起，A组与B组隆起的视网膜分别于注射后2周和1周左右平复。视网膜下注射bFGF后2-12周FFA检查可见原注射隆起处下方造影早期出现斑点状高荧，后期高荧斑逐渐融合扩大，荧光强度逐渐增强。ICGA显示FFA高荧相应部位荧光染料积存。对照眼FFA、ICGA检查均未见明显高荧灶或荧光染料积存。病理检查结果显示：视网膜下注射bFGF后2-12周，视网膜下有脉络膜新生血管形成。 结论：视网膜下注入具有生物活性的bFGF能够成功诱导色素兔脉络膜 新生血管形成。该动物模型可重复性较好，能够模拟人眼CNv的病理状态，可用作研究CNV的疾病转归、评价安全有效的防治手段的实验平台，尤其适用于研究激光治疗CNV的安全性和疗效。