甲维盐对松材线虫作用机理初探

来源 :浙江农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jluzoro
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甲维盐(emamectin benzoate,EB)是一种常用的十六元大环内酯化合物(16-membered macrolide lactones),它由阿维菌素衍生合成,杀虫活性比阿维菌素高出数个数量级,且对哺乳动物的毒性低,是目前应用最广泛的高效低毒广谱杀虫剂,也是树干注药防治松材线虫的主要药剂之一,但尚未有研究验证其对松材线虫作用机理。本论文克隆出编码松材线虫谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channel,GluCl)和γ-氨基丁酸门控氯离子通道(γ-aminobutyric acid-gated chloride channel,GABACl)的基因,验证了这两个作用靶标与甲维盐及几种十六元大环内酯化合物的亲和作用。主要结果如下:1.通过生物测定明确了低剂量甲维盐对松材线虫的毒力作用。浓度为0.1 mg/L的甲维盐处理能够显著降低松材线虫雌虫平均产卵量(F=145.25,P<0.001)、抖动频率(F=141.97,P<0.001),且能抑制其发育进度(F=175.75,P<0.001),对后代性别比例则无显著影响(F=1.412,P=0.281),表明低剂量甲维盐对松材线虫的繁殖、发育、运动均有影响。2.通过转录组测序筛选0.1 mg/L甲维盐胁迫下松材线虫的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。处理12 h,各RNA-seq库间只有7个DEGs;处理24 h,共筛选出5741个DEGs,其中甲维盐与助剂对照处理24 h样品(EB24与ON24)对比结果中,共有758个基因上调表达,562个基因下调表达,它们的生物学功能分别与生活史、神经与运动系统、外源性物质代谢及致病性相关。通过qPCR验证转录组测序结果,果胶裂解酶(F=151.9,P<0.001)和β-1,4-内切葡聚糖酶(F=735.2,P<0.001)基因经甲维盐处理显著下调表达,谷氨酸门控氯离子通道(F=35.0,P<0.001)、γ-氨基丁酸β受体(F=15.8,P<0.001)、UDP葡萄糖醛酸转移酶(F=17.0,P<0.001)和ABC转运蛋白(F=23.1,P<0.001)基因则显著上调,相对表达水平变化趋势与转录组测序结果相符,证明了转录组数据准确可靠。生物信息学分析结果表明,筛选出的BxGluCl和BxGABACl基因均具备半胱氨酸环配体门控离子通道(cysteine-loop ligand-gated ion channel super family,cys-loop LGICs)超家族的典型结构特征;系统发育树构建结果表明,BxGluCl和BxGABACl与其他线虫的氯离子通道基因具备高度同源性。推断BxGluCl和BxGABACl具备氯离子通道蛋白功能,且能够完整表达。3.使用PCR扩增和重组质粒构建技术克隆目的基因,并通过qPCR分析松材线虫BxGluCl和BxGABACl在不同龄期的表达水平及化合物处理后的表达模式。PCR扩增得到电泳结果符合预期大小的目的条带,使用pGEM-T Easy载体构建重组质粒并导入大肠杆菌,提取得到质粒测序,序列与预期相符,克隆出的BxGluCl和BxGABACl片段长度分别为1386 bp和1446 bp。BxGluCl和BxGABACl均在卵期表达量较低,二龄至四龄(J2-J4)幼虫表达量较高,成虫期则达到最高表达水平。甲维盐处理12 h内,成虫体内BxGluCl(F=2.308,P=0.203)和BxGABACl(F=4.654,P=0.097)表达量均未发生显著变化,24 h后则均显著上升(F=8.248,P=0.019;F=8.436,P=0.018);对照药剂噻虫啉处理后48 h内BxGluCl和BxGABACl表达水平均不发生显著变化。4.使用RNAi技术明确了十六元大环内酯化合物对松材线虫的作用靶标。松材线虫成虫经合成的BxGluCl和BxGABACl的dsRNA(dsBxGluCl和dsBxGABACl)浸泡干扰24 h后,BxGluCl和BxGABACl沉默效率分别达54.93%和38.53%,RNAi沉默效率较高。使用不同剂量的甲维盐、天维菌素A、天维菌素B、阿维菌素B1a和噻虫啉进行生物测定,松材线虫经RNAi后,对4种十六元大环内酯化合物的敏感性均显著下降,对新型氯代烟碱杀虫剂噻虫啉的敏感性则无显著变化;松材线虫经BxGluCl和BxGABACl的混合dsRNA(dsMix)沉默后抖动频率亦显著降低(F=6.310,P=0.036)。说明甲维盐等十六元大环内酯化合物作用靶标为松材线虫的BxGluCl和BxGABACl蛋白。
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