【摘 要】
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牡丹（Paeonia suffruticosa）是我国传统名花,花叶兼美,多年来深受国民的喜爱,广泛应用于园林绿化。牡丹不耐高温,尤其是夏季高温和日灼现象限制了牡丹的生长和观赏品质。本研究以江南牡丹‘羽红’（P.suffruticosa‘Yuhong’）为研究对象,通过对高温胁迫处理的转录组测序与分析,筛选获得响应高温胁迫相关的热激蛋白HSP基因,克隆得到了3个小分子热激蛋白基因PsHSP17.8
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牡丹（Paeonia suffruticosa）是我国传统名花,花叶兼美,多年来深受国民的喜爱,广泛应用于园林绿化。牡丹不耐高温,尤其是夏季高温和日灼现象限制了牡丹的生长和观赏品质。本研究以江南牡丹‘羽红’（P.suffruticosa‘Yuhong’）为研究对象,通过对高温胁迫处理的转录组测序与分析,筛选获得响应高温胁迫相关的热激蛋白HSP基因,克隆得到了3个小分子热激蛋白基因PsHSP17.8、PsHSP21和PsHSP27.4,对其进行生物信息学和基因表达分析,以及遗传转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）并对转基因株系的耐热性进行探究。主要研究结果如下:1.通过对高温胁迫下牡丹‘羽红’的叶片组织进行转录组测序,共获得45.97 Gb Clean date,54 935个Unigene,其中差异基因7 673个,4 220上调表达,3 453个下调表达。对差异基因进行GO功能注释和KEGG途径分析,GO功能组中代谢过程、细胞和结合活性是序列数较多的组,KEGG途径中碳代谢和内质网的蛋白加工是基因富集最多的2个途径组。另外,通过差异分析获得18个热激蛋白HSP基因,在高温处理下均呈现显著性上调表达。2.依据转录组测序得到的sHSP序列数据,克隆并获得了ORF长分别为459、714和693 bp的3个小分子热激蛋白基因（PsHSP17.8,PsHSP21和PsHSP27.4）,分别编码152、237和230个氨基酸,3个基因都包含HSP20结构域;进化树分析显示PsHSP17.8属于胞质Class I型,PsHSP21和PsHSP27.4属于叶绿体型小热激蛋白。荧光定量结果显示,PsHSP17.8和PsHSP21在40℃高温处理后2 h显著上调表达,PsHSP27.4高温胁迫后6 h显著上调表达,说明PsHSP17.8,PsHSP21和PsHSP27.4均能参与牡丹热胁迫的响应。3.通过双酶切的方法将PsHSP17.8,PsHSP21和PsHSP27.4构建表达载体,酶切位点为Xho I和Cla I,农杆菌异源转化拟南芥。组织定量表明PsHSP17.8、PsHSP21、PsHSP27.4基因均在转基因株系叶片的表达水平最高。对PsHSP17.8、PsHSP21、PsHSP27.4转基因拟南芥株系进行高温处理,恢复期后的成活率分别为43%、36%、31%,高温胁迫后转基因株系叶长和叶宽均大于野生型。高温处理后,相关生理指标显示转基因株系的超氧化物歧化酶活性、游离脯氨酸的累积程度和叶绿素水平均高于野生型株系,而丙二醛含量和电导率均低于野生型株系,野生型植株的膜脂过氧化反应更为强烈。初步说明牡丹小热激蛋白基因PsHSP17.8、PsHSP21、PsHSP27.4可以提升拟南芥的高温耐性。综上,小分子热激蛋白PsHSP17.8、PsHSP21、PsHSP27.4在牡丹高温胁迫的调节过程中发挥作用。本研究为解析牡丹的高温响应和耐高温牡丹种质创新提供参考依据。
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