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背景:前期研究中,通过骨质疏松和非骨质疏松患者骨组织外泌体代谢组学分析发现,棕榈油酸表达差异显著,推测代谢物分子可能通过外泌体介导的方式在破骨分化过程中发挥作用。研究表明中药成分紫草素可能通过影响外泌体的分泌及其携带因子的表达对生物学过程发挥作用。中医学认为骨质疏松症多属“骨痿”范畴,肾虚是发病的根本原因,肾为先天之本,主骨生髓。同时,大量临床实践也发现,从肾论治的同时结合通络健脾疏肝等法会取得更好的疗效,肝藏血主疏泄而主筋,肾藏精主封藏而主骨,《医宗必读》中提到“肝肾同源”,肝藏血,肾藏精,肝为肾之子,肝血滋养肾精,紫草归心肝经,可凉血、活血,结合外泌体的作用,通利水道,才能使肾中精气更好的得到补充,填精益髓以治骨痿。目的:探究棕榈油酸通过外泌体介导的方式对破骨细胞分化的影响,探究SCD1基因敲除对小鼠骨骼表型的影响,并阐明紫草素在此过程中的对外泌体形成和破骨细胞分化的作用机制。方法:（1）建立ST2细胞体外成骨分化模型,通过茜素红染色、ALP酶活检测、RT-q PCR成骨标志性基因表达检测鉴定成骨能力;提取ST2细胞成骨分化成熟期细胞培养液上清外泌体并进行形态、粒径和标志性蛋白表达鉴定;对成骨诱导0、3、7、14天ST2细胞培养液上清来源的外泌体进行棕榈油酸靶向代谢组学分析;（2）利用CRSPR/Cas9技术构建棕榈油酸合成关键酶SCD1敲除小鼠模型,鼠尾鉴定纯合子后进行繁育,用micro CT的方法对野生型和敲除型小鼠分别进行骨组织形态检测并比较BMD、BV/TV、BS/BV、BS/TV、Tb.Sp、Tb.Th参数;紫草素灌胃6周后,micro CT检测骨骼参数变化,制备野生型和敲除型骨组织切片进行HE和TRAP染色检测;对野生型和敲除型小鼠骨组织提取外泌体进行代谢组学检测;提取野生型和敲除型小鼠BMDM细胞添加m-CSF和RANKL进行破骨诱导,TRAP染色和RT-q PCR检测破骨标志性基因表达,并观察添加紫草素后表达趋势的变化;（3）构建慢病毒稳转ST2细胞系,通过茜素红染色、ALP酶活检测和RT-q PCR检测标志性基因表达,检测SCD1基因表达下调后,对细胞成骨分化的影响以及添加紫草素后变化趋势的变化情况;将野生型ST2细胞来源、稳转ST2细胞来源和培养体系加入紫草素的稳转ST2细胞来源的外泌体与破骨细胞共培养,通过TRAP染色和RT-q PCR检测破骨标志性基因表达检测其对细胞破骨分化的影响,观察紫草素在此过程中的影响;（4）NTA检测紫草素对稳转细胞系ST2细胞外泌体分泌浓度的影响,以及紫草素对RAW264.7细胞外泌体分泌浓度的影响;对有无紫草素干扰提取的稳转细胞系和RAW264.7细胞来源的4种外泌体进行蛋白质谱检测和分析,并对差异表达的蛋白进行聚类分析;（5）筛选出加入紫草素后外泌体中差异表达显著的蛋白RAB11A,用RAB11A激活剂作用于破骨分化培养体系中,检测其对破骨细胞分化的影响,并检测在此过程中紫草素所发挥的作用。结果:（1）采用在培养体系中添加50μg/ml抗坏血酸、10 m Mβ-磷酸甘油、10n M地塞米松的方法成功建立ST2细胞体外成骨分化模型,在成骨分化的第0、3、7、14天分别进行检测,随诱导时间的延长,钙结节的产生逐渐增多,ALP酶活性随诱导时间的延长呈现先升高后下降的趋势,Runx2、ALP基因表达呈先上升后略有下降的趋势,COL1A1和OCN基因表达呈逐渐上升趋势,这与茜素红染色和ALP酶活检测的结果相一致。我们采用Exo Quick TM试剂提取ST2成骨分化14天培养液上清的外泌体沉淀,经透射电子显微观察发现外泌体直径约30-400nm左右,为双层膜膜包被小泡,且表达膜标志性蛋白CD81、CD9和Hsp70,通过NTA检测外泌体的浓度为1.5×1012个/ml,直径范围在50-500nm左右;对0、3、7、14天ST2培养液中外泌体进行游离脂肪酸GC-MS分析,系统聚类分析和盒图分析结果均显示随着ST2细胞成骨诱导天数的增加,棕榈油酸的表达量逐渐升高,提示我们其在成骨分化后期可能发挥重要作用。（2）鼠尾鉴定结果表明,只存在452bp处一条带的是纯合子小鼠,敲除型小鼠与野生型小鼠相比,SCD1（-/-）小鼠明显体长短、体重轻,且周身毛发稀疏;敲除型小鼠和野生型小鼠micro CT检测结果表明,敲除型小鼠与野生型相比,BMD显著下降,BV/TV、BS/BV、BS/TV均呈显著下降趋势,Tb.Sp增加,Tb.Th减少;HE染色结果显示,SCD1敲除型小鼠与野生型相比,骨小梁结构稀疏数量减少,骨密度降低,骨髓腔内空泡增加,紫草素给药之后,敲除型小鼠骨小梁结构大大改善,骨密度升高,并且骨髓腔空泡数量也相对较少,表明紫草素对敲除型小鼠骨骼表型有较好的缓解作用。TRAP染色结果表明,敲除型小鼠与野生型小鼠相比,破骨细胞数量明显增多,紫草素给药之后,敲除型小鼠破骨细胞数量大大减少,表明紫草素对破骨细胞分化和成熟有较好的抑制作用;敲除型小鼠和野生型小鼠骨组织来源的外泌体经鉴定之后,进行基于LC-MS/MS的代谢组学分析,筛选出显著差异的代谢物,差异代谢物的KEGG注释结果表明,差异代谢物多集中在代谢途径、脂肪酸生物合成、不饱和脂肪酸生物合成等信号通路中,IPA分析结果也表明,脂类代谢信号通路差异表达明显,这与前期人源骨组织来源外泌体代谢组结果基本吻合;BMDM细胞破骨诱导检测,敲除型小鼠NFATc1、TRAP、CSTK基因表达高于野生型组,紫草素给药6周之后,基因表达呈现下降趋势。（3）将sh RNA转入ST2细胞,经嘌呤霉素筛选,病毒转染效率均达85%以上,建立稳转ST2细胞系,经SCD1基因和蛋白表达均显著下降,sh RNA干扰ST2细胞系构建成功;稳转细胞系进行成骨诱导,茜素红染色检测结果表示干扰组细胞钙结节的产生下降显著,加人0.5μM紫草素后,茜素红染色的红色稍有增多,但没有统计学差异;成骨标志性基因表达检测结果显示,干扰组Runx2、ALP、COL1A1、OCN基因表达均呈下降趋势,紫草素干预之后,空转组和干扰组均呈现一定程度的表达上调的趋势,ALP活性检测结果与RT-q PCR结果相一致,这表明干扰Scd1基因表达对细胞成骨分化能力产生了显著的影响;干扰组ST2细胞外泌体可以进入RAW264.7细胞;外泌体共培养后,TRAP染色结果表明,干扰组来源的外泌体会使破骨细胞的数量轻微上升,趋势不显著,RT-q PCR结果显示,干扰组来源的外泌体会使破骨标志性基因NFATc1、TRAP、CTSK表达显著上调,紫草素干预组则呈现表达下降的趋势,有统计学差异,并且下调到与对照组表达程度接近的水平。（4）在sh RNA干扰ST2细胞成骨分化体系中加入0.5μM紫草素,不加紫草素组,胞外基质来源外泌体浓度为1.3×1011/m L,加紫草素组,胞外基质来源外泌体浓度为1.2×1011/m L;不加紫草素组,培养液上清来源外泌体浓度为3.1×1011/m L,加紫草素组,培养液上清来源外泌体浓度为8.0×1010/m L,加入紫草素后ST2细胞外泌体浓度变化不大;在RAW264.7细胞破骨诱导体系中加入0.5μM紫草素,RAW264.7细胞破骨诱导2天不加紫草素组培养液上清来源外泌体浓度为6.0×1012/m L,外泌体直径分布峰值在400nm左右,RAW264.7细胞破骨诱导2天加紫草素组培养液上清来源外泌体浓度为1.7×1011/m L,外泌体直径分布峰值在500nm左右,RAW264.7细胞破骨诱导6天不加紫草素组培养液上清来源外泌体浓度为1.8×1012/m L,外泌体直径分布峰值在300-1000nm左右,RAW264.7细胞破骨诱导6天加紫草素组培养液上清来源外泌体浓度为2.5×1010/m L,直径分布峰值在300-1000nm左右,加入紫草素后外泌体浓度呈显著下降趋势,且外泌体的粒径分布也略有下降;分别提取含（不含）0.5μM紫草素干扰ST2细胞和RAW264.7细胞培养液上清的外泌体共4组外泌体,进行4D label-free蛋白质组定量技术检测,显示外泌体中蛋白在各个分子量都有分布,且分布较为均匀,质谱分析发现干扰ST2细胞外泌体紫草素处理组相对于对照组下调蛋白130种,上调蛋白80种,RAW264.7细胞外泌体紫草素处理组相对于对照组下调蛋白49种,上调蛋白174种,差异蛋白生物学过程富集情况聚类分析结果显示,参与胞外基质组织、胶原纤维组织、脂肪酸生物合成的调节等过程的蛋白差异显著,这提示我们紫草素影响成骨细胞和破骨细胞来源外泌体的功能,可能通过脂肪酸代谢或胞外基质蛋白功能发挥作用。（5）在RAW264.7细胞破骨诱导体系中添加RAB11A激活剂QX77后,破骨细胞标志性基因NFATc1、TRAP、CSTK表达均呈现上升趋势,TRAP染色实验也显示破骨细胞多核细胞形成增多加入紫草素后,多核细胞数量显著下降,这表明紫草素可通过抑制RAB11A的作用进而抑制破骨细胞分化。结论:外泌体棕榈油酸在细胞成骨分化过程中表达上调;SCD1-/-小鼠表现出一定程度骨质疏松的表型,且紫草素对SCD1-/-小鼠骨骼表型有纠正作用;稳转ST2细胞成骨能力下降,外泌体对RAW264.7细胞分化抑制作用减弱,紫草素干预后可有效逆转;紫草素可抑制RAW264.7细胞来源外泌体的分泌,并对稳转ST2细胞和RAW264.7细胞外泌体的蛋白谱表达产生影响,其中RAB11A表达有显著差异,并且RAB11A在外泌体生成的过程中发挥重要作用;激活RAB11A表达会促进RAW264.7细胞破骨分化,紫草素可抑制上述作用。综上,代谢物可以外泌体介导的方式在RAW264.7破骨分化中发挥作用,SCD1基因敲除后会显著影响小鼠骨骼表型;紫草素处理,可以影响细胞外泌体的分泌和蛋白质谱发生改变,还可能通过RAB11A通路抑制破骨细胞外泌体的分泌和破骨分化。