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肝纤维化是各种原因所致肝脏疾病的共同病理表现,其特点是肝脏内弥漫性纤维增生伴降解不足,细胞外基质大量沉积,持续发展演进为肝硬化。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）的激活是肝纤维化进展过程中的关键事件。研究显示HSC的活化与氧化应激密切相关,细胞内活性氧ROS升高能促进纤维化信号通路TGF-β/SMAD的传导。使用抗氧化剂阻断ROS的产生能抑制HSC的活化和细胞外基质的分泌,延缓肝纤维化进程。咪唑啉I2受体（I2R）在机体内分布广泛,前期实验证实I2R抑制剂具有良好的抗炎、抗氧化应激的效应,但是否具有抗纤维化作用尚不清楚。本实验选用常用的I2R抑制剂咪唑克生（Idazoxan,IDA）作为研究对象,构建CC14诱导的肝纤维化小鼠模型和TGF-β1刺激的HSC系LX2细胞模型,阐明咪唑克生在预防肝纤维进展中的作用和相关分子机制,为临床预防和治疗肝纤维化做些探索性工作。第一部分:咪唑克生对CCl4诱导的肝纤维化小鼠的保护作用目的:构建CC14诱导的肝纤维化小鼠模型和TGF-β刺激的LX2细胞模型,检测咪唑克生的抗纤维化保护作用。方法:1、体内实验:选取18-22g雄性C57BL/6J小鼠40只,随机分为4组:正常对照组（8只）、咪唑克生对照组（8只）、肝纤维化模型组（8只）和咪唑克生治疗组（8只）。将CC14和橄榄油以2:3体积比混合,通过腹腔注射各组小鼠,每周两次,每次0.8ml/kg。咪唑克生注射剂量为3mg/kg,每次与CC14同时注射。在第8周时,称重后处死所有小鼠,收集血清和肝脏标本。HE、天狼星红和Masson染色观察肝组织病理和纤维化改变,血生化检测丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和总胆红素（TBil）的含量,ELISA检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的水平,免疫组化检测肝组织中α-SMA和Col1的表达,Western Blot检测肝组织中p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3和SMAD3的表达。2、体外实验:体外培养人永生化肝星状细胞系LX2细胞,随机分为5组:正常对照组（PBS）、TGF-β刺激组（5ng/ml TGF-β）、低剂量咪唑克生治疗组（25μM IDA+5ng/ml TGF-β）、中剂量咪唑克生治疗组（50μM IDA+5ng/ml TGF-β）和高剂量咪唑克生治疗组（100μM IDA+5ng/ml TGF-β）。Western Blot检测细胞浆和细胞核中p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3和SMAD3的表达,以及细胞中α-SMA和Col1的表达。结果:1、体内实验:CC14腹腔注射8周后,肝纤维化模型组小鼠体重减轻、肝重增加、肝重体重比明显增高,而咪唑克生治疗组小鼠有明显改善。HE、天狼星红和Masson染色显示,肝纤维化模型组小鼠肝脏出现肝细胞变性坏死、肝小叶结构紊乱、中央静脉周围及汇管区纤维沉积,而咪唑克生治疗组小鼠有明显改善。血生化和ELISA检测显示,咪唑克生能明显减轻肝纤维化小鼠血清中ALT、AST、TBil、IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β的含量。Western Blot检测显示,咪唑克生能明显减轻肝纤维化小鼠肝脏中SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。2、体外实验:TGF-β诱导活化的LX2细胞在受到咪唑克生干预处理后,SMAD2和SMAD3的磷酸化明显降低、转位入核受限,α-SMA和Col1的表达也明显减少。结论:咪唑克生可以预防和改善CC14诱导的小鼠肝脏纤维化,其作用机制与抑制肝星状细胞TGF-β-SMAD信号通路的活化有关。第二部分:咪唑克生通过激活NRF2信号通路抑制肝脏氧化应激反应目的:检测咪唑克生在肝纤维化小鼠模型和LX2细胞模型中的抗氧化应激作用,同时验证这种作用是否与NRF2信号通路的活化有关。方法:1、在正常对照组、咪唑克生对照组、肝纤维化模型组和咪唑克生治疗组共4组小鼠中,使用Western Blot检测超氧化物歧化酶-2（SOD2）、过氧化氢酶（CAT）、血红素氧合酶（HO-1）、依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化还原酶（NQO-1）和Nrf2的表达,酶活力试验检测肝组织总SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的酶活力。在正常对照组、TGF-β刺激组、低剂量咪唑克生治疗组、中剂量咪唑克生治疗组和高剂量咪唑克生治疗组共5组LX2细胞中,使用Western Blot检测SOD2、CAT、HO-1和NQO-1表达,以及Nrf2和Keap1分别在细胞浆和细胞核内的表达,细胞免疫荧光检测NRF2在细胞内定位,EMSA实验检测NRF2与DNA的结合活力。2、体内基因沉默:选取18-22g雄性C57BL/6J小鼠36只,随机分为正常对照组（12只）、肝纤维化模型组（12只）和咪唑克生治疗组（12只）共3大组。每大组又分为2小组,分别注射对照腺病毒和NRF2腺病毒沉默颗粒。将CC14和橄榄油以2:3体积比混合,通过腹腔注射各组小鼠,每周两次,每次0.8ml/kg。咪唑克生注射剂量为3mg/kg,每次与CC14同时注射。在注射8周后,处死所有小鼠,收集血清和肝脏标本。HE和天狼星红染色观察肝组织纤维化改变,酶活力试验检测肝组织中GPx和SOD的酶活力,Western Blot检测肝组织中HO-1、NQO-1、p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3、SMAD3、α-SMA和Col1的表达。3、体外基因沉默:将体外培养的LX2细胞随机分为正常对照组（PBS）、TGF-β刺激组（5ng/ml TGF-β）和咪唑克生治疗组（100μM IDA+5ng/ml TGF-β）共3大组。每大组又分为2小组,分别给予对照慢病毒和NRF2慢病毒沉默颗粒刺激。酶活力试验检测细胞中GPx和SOD的酶活力,Western Blot检测细胞HO-1、NQO-1、p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3、SMAD3、α-SMA和Col1的表达,细胞免疫荧光检测α-SMA的表达。结果:1、肝纤维化小鼠肝组织中SOD2和CAT的表达较对照组明显降低,SOD和GPx酶活力明显减弱,而咪唑克生治疗后能明显改善。TGF-β刺激LX2细胞能明显降低SOD2和CAT的表达和酶活力,同时促进活性氧ROS的产生,而咪唑克生治疗后能明显改善。2、咪唑克生能显著促进肝纤维化小鼠HO-1、NQO-1和Nrf2的表达,同时能促进LX2细胞中HO-1和NQO-1的表达,以及Nrf2的转位入核和与DNA结合力。3、在小鼠体内抑制NRF2的表达后,HE和天狼星红染色显示咪唑克生对纤维化小鼠肝脏保护作用减弱,酶活力实验显示咪唑克生对SOD和GPx酶活力的促进作用明显减弱,Western Blot显示咪唑克生对抗氧化酶HO-1和NQO-1表达的促进作用明显减弱,对SMAD2/3磷酸化和α-SMA、Col1的表达的抑制作用明显减弱。4、在LX2细胞中抑制NRF2的表达后,酶活力试验显示咪唑克生对SOD和GPx酶活力的促进作用明显减弱,Western Blot和免疫荧光试验显示咪唑克生对抗氧化酶HO-1和NQO-1表达的促进作用明显减弱,对SMAD2/3磷酸化和α-SMA、Col1的表达的抑制作用明显减弱。结论:咪唑克生能够抑制CC14诱导的肝纤维化小鼠的氧化应激反应,从而抑制HSC的活化和小鼠肝纤维化的进展,其作用机制与促进NRF2信号通路的活化有关。第三部分:咪唑克生通过AKT-NRF2-SMAD信号通路抑制HSC活化和肝纤维化进展目的:检测咪唑克生对肝纤维化小鼠和TGF-β刺激的LX2细胞中AKT信号通路的作用,同时验证咪唑克生是否通过AKT-NRF2信号通路发挥抗纤维化作用。方法:1、在正常对照组、咪唑克生对照组、肝纤维化模型组和咪唑克生治疗组共4组小鼠中,使用Western Blot检测p-AKT和AKT的表达;在正常对照组、咪唑克生对照组、TGF-β刺激组、低剂量咪唑克生治疗组、中剂量咪唑克生治疗组和高剂量咪唑克生治疗组共5组LX2细胞中,使用Western Blot检测p-AKT和AKT的表达。2、选取18-22g雄性C57BL/6J小鼠32只,随机分为4组:正常对照组（8只）、肝纤维化模型组（8只）、咪唑克生治疗组（8只）、哌立福辛干预组（8只）。将CC14和橄榄油以2:3体积比混合,通过腹腔注射各组小鼠,每周两次,每次0.8ml/kg,复制肝纤维化模型。咪唑克生注射剂量为3mg/kg,哌立福辛（PE）注射剂量为20mg/kg,每次与CC14同时注射。在注射8周后,处死所有小鼠,收集血清和肝脏标本。天狼星红染色观察肝组织纤维化改变,免疫组化观察肝脏α-SMA表达,Western Blot检测肝组织中p-AKT、AKT、NRF2、HO-1、NQO-1、p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3和SMAD3的表达。3、将体外培养的LX2细胞随机分为4组:正常对照组（PBS）、TGF-β刺激组（5ng/ml TGF-β）、咪唑克生治疗组（100μM IDA+5ng/ml TGF-β）和哌立福辛干预组（5μM PE+100μM IDA+5ng/ml TGF-β）。Western Blot检测细胞浆p-AKT、AKT、p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3、SMAD3、α-SMA和Col1的表达,以及细胞核NRF2、SMAD2和SMAD3的表达,免疫荧光检测NRF2的细胞定位,EMSA检测NRF2与DNA的结合活力。结果:1、在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型和TGF-β刺激的LX2细胞模型中,咪唑克生能显著促进AKT的磷酸化表达。2、在小鼠体内使用哌立福辛抑制AKT磷酸化表达后,天狼星红染色显示咪唑克生对纤维化小鼠肝脏的保护作用明显减弱,Western Blot和免疫组化显示咪唑克生对NRF2、HO-1和NQO-1表达的促进作用明显减弱,对SMAD2/3的磷酸化和α-SMA表达的抑制作用明显减弱。3、在LX2细胞中使用哌立福辛抑制AKT磷酸化表达后,Western Blot和免疫荧光显示咪唑克生对NRF2的转录入核和DNA结合力的促进作用明显减弱,对SMAD2/3的磷酸化以及α-SMA和Col1的表达的抑制作用明显减弱。结论:咪唑克生能够抑制CC14诱导的肝纤维化小鼠的氧化应激反应和纤维化进展,其作用机制与调控肝星状细胞AKT-NRF2-SMDA信号通路的传导有关。