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类胡萝卜素(carotenoids)是一类呈现黄色、橙色或红色的天然色素,它们在自然界广泛存在于各种植物中,在动物和微生物中也有发现.
类胡萝卜素是植物和微生物光合膜的组成部分,可保护光合系统免受强光氧化破坏.许多类胡萝卜素是维生素A的重要来源,又是强抗氧化剂,具有一定的癌症预防功效.虽然类胡萝卜素及其合成酶类在植物和微生物中含量丰富,但单一色素的提取和合成酶复合体的纯化都比较困难.不同生物类胡萝卜素合成基因的相继克隆和合成途径中相关酶的纯化,为类胡萝卜素合成相关酶及多酶复合体的研究提供了便利,也为利用微生物发酵来获取类胡萝卜素提供了可能.烟草作为以叶片为主要收获对象的一种重要经济作物,研究其叶片在紫外胁迫下,类胡萝卜素等光合色素含量及其与类胡萝卜素合成有关的酶等抗紫外胁迫蛋白的变化情况具有重要意义.
本实验从噬夏孢欧文氏菌中克隆了类胡萝卜素合成相关基因crtE, crtB,crtI,crtY分别构建了生产番茄红素和β-胡萝卜素的工程菌,研究了两工程菌的培养条件与类胡萝卜素累积之间的关系.并从生产番茄红素的工程菌中纯化了类胡萝卜合成早期多酶复合体,还检测了UV-B辐射增加的情况下,烟草叶片中类胡萝卜素等光合色素和与类胡萝卜素合成有关的酶等生理生化指标的变化.主要结果如下:1.重组质粒的构建和类胡萝卜素合成相关酶的纯化噬夏孢欧文氏菌番茄红素合成相关基因crtE,crtB,crtI同时克隆进表达载体pET-15b构建pET-15bcrtIEB,β-胡萝卜素合成相关基因crtY首先克隆进pET-15b,构建pET-15bcrtY,再将crty连同T7启动子和终止子切下,插入pACYC-184构建oACYC-184crtY.将重组质粒pET-15bcrtlEB转化EcoliBL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌表达蛋白,菌体经超声波破碎、高速离心后,上清液经镍离子螯合树脂亲和层析和凝胶过滤层析纯化分离出相对分子质量分别为209KD、105KD和70KD的类胡萝卜素合成前期蛋白复合体.
另外,分别构建含重组质粒pET-15bcrtE、pET-15bcrtlB的工程菌,分别从上清中纯化出GGPP合成酶和八氢番茄红素合成酶,体外混合后凝胶过滤层析纯化分离出相对分子质量分别为209KD、173KD和70KD类胡萝卜素合成前期蛋白复合体.经SDS-PAGE电泳和Western blot检测并结合分子量分析,推测本实验所纯化到的类胡萝卜素合成前期蛋白复合体由4个GGPP合成酶、2个八氢番茄红素合成酶组成,相对分子质量分别为209KD,催化GGPP至八氢番茄红素的合成;GGPP合成酶至少以二聚体形式存在.2.生产番茄红素的大肠杆菌工程菌及其培养条件的研究IPTG诱导含重组质粒pET-15bcrtlEB的工程菌,菌体累积红色色素,经HPLC和吸收光谱分析,确定工程菌中合成的色素为番茄红素.
研究了碳源、氮源、金属离子、培养温度、诱导剂浓度、诱导时间等参数对工程菌生长及色素累积的影响,确定了合适的培养条件:培养基为改良LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、柠檬酸钠5g/L、MgCl<,2> 0.1g/L,NaCl 10g/L);起始培养温度为37℃;培养至OD<,600>为0.6左右时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,诱导温度降至30℃;诱导时间为14h.发酵完成后工程菌的生物量(干重)为5.45g/L,番茄红素的最高含量可达5.8mg/gDCW3.生产β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌及其培养条件的研究将两重组质粒pET-15bcrtEIB和pACYC-184crtY共转化EcoliBL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌累积橙色色素,经吸收光谱分析,确定工程菌中合成的色素为β-胡萝素.
研究了碳源、氮源、金属离子、培养温度、光照、pH值、诱导时间等参数对工程菌生长及色素累积的影响,确定了合适的培养条件:培养基为改良LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、可溶性淀粉5g/L、MgCl<,2> 0.04g/L、FeCl<,3>0.01g/L、NaCI 10g/L,pH5.8);光照;起始培养温度为37℃;培养至OD<,600>为0.6左右时加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,诱导温度降至30℃;诱导时间为14h.发酵完成后工程菌的生物量(干重)为6.53g/L,β-胡萝卜素的最高含量可达3.5mg/gDCW4.紫外线-B辐射对烟草光合色素和几种酶的影响研究了紫外线(UV-B)胁迫条件下,烟草叶片相关生理生化指标的变化情况.结果表明,紫外线-B辐照后,烟草叶片内光合色素(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)的含量均呈上升趋势,三种色素比对照分别上升了21﹪、10﹪、27﹪;可溶性蛋白含量呈先上升后下降趋势;过氧化物酶活性明显上升,同工酶图谱分析证实,有一种新的过氧化物酶同工酶表达;利用重组噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)GGPP合成酶免疫家兔,制备了兔抗GGPP合成酶的抗血清.Western blot检测显示,紫外线-B辐照可使烟草叶片GGPP合成酶(GGPS)的表达量显著提高.