研究目的慢性难愈合伤口由严重外伤、烧伤、放射性损伤、糖尿病等因素引起。糖尿病的慢性难愈合皮肤创面因神经及血管病变等导致局部缺血及组织营养障碍,在其创面修复过程中易出现伤口经久不愈的症状。在损伤后期,由于上皮持续损伤、机体防御机制破坏等原因,难愈合伤口易继发细菌感染。糖尿病患者眼角膜损伤后期继发感染性角膜炎的发病率已高达半数以上,其感染后在短时间内诱发失控性炎症反应,形成极严重的急性化脓性角膜溃疡蔓延至全角膜甚至全眼球。近年来临床上细菌耐药形势愈加严峻,而在其治疗过程中,传统抗生素更遭遇瓶颈。探索研究对抗耐药菌感染同时促进伤口愈合的新方法成为医药界面临的课题。本课题针对慢性难愈合伤口和角膜炎治疗中的抗感染和促愈两大难题,设计一系列协同近红外激光光热治疗的新型无机纳米生物材料,在体外细胞和体内糖尿病小鼠动物模型中系统地研究所制材料在耐药菌感染的慢性难愈合伤口和角膜炎方面的抗菌促愈功能和机理,为研究开发新型治疗手段奠定基础。研究方法(1)采用一步合成法、模板法构建三角形银纳米颗粒、超小尺寸硫化铜纳米点和金银氧化亚铜复合纳米壳三种新型无机纳米生物材料。通过高分辨率透射电镜、紫外可见光分光光度计、动态光散射仪、X射线衍射仪等实验技术对纳米材料的形貌结构及光学吸收性质、热稳定性、光热转化效率等进行表征测试。(2)在体外细菌和细胞模型中,采用噻唑蓝比色法、浊度法、涂板法、荧光标记法、透射电镜、扫描电镜、划痕法、脉管生成法等实验方法,通过统计学定量分析评价并考察纳米材料的体外抗菌疗效和机理。(3)建立耐药菌感染的BALB/c小鼠,糖尿病db/db小鼠皮肤伤口和角膜炎动物模型,通过热成像仪检测法、监测伤口闭合率、眼科临床评分和病理组织学分析等实验技术,评价纳米材料在体内的抗菌和促愈合的疗效。(4)通过相关免疫组化分析、蛋白质印迹和定量聚合酶链反应测试,揭示纳米治疗促进愈合的主要信号通路。(5)通过体重监测、溶血实验、生化指标检查、血液学分析、主要脏器组织学检查等手段进行毒理学考察。研究结果本研究成功构建了三角形银纳米颗粒、超小尺寸硫化铜纳米点和金银氧化亚铜复合纳米壳三种新型无机纳米生物材料。研究结果表明,近红外激光诱导的三角形银纳米颗粒在体外和体内实验中均可以显著抑制临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌这两种多重耐药菌株。在小鼠耐药菌感染的皮肤创口上可加速创口结痂和收缩,初步显示出一定的促愈合疗效。协同近红外激光的硫化铜纳米点不仅可有效杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌,还可释放铜离子促进成纤维细胞迁移和血管内皮细胞再生,从而有效加速耐药菌感染的慢性伤口愈合。核壳结构的金银氧化亚铜复合纳米壳综合了前两种纳米材料的优势,不但可通过联合近红外激光激活中空金银合金核心释放银离子、产生光热效应和光动力效应从而有效杀灭多重耐药菌,而且同时可控制氧化亚铜壳层释放铜离子从而促进周围上皮细胞迁移,在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的糖尿病小鼠慢性难愈合皮肤伤口和角膜炎疾病模型中,均被证实可有效消除多重耐药菌感染,同时促进慢性创伤愈合,从而达到治愈目的。在治疗剂量条件下,三种材料均未显示出对小鼠体重、血液和主要脏器的明显毒性。研究结论本研究针对临床上慢性难愈合伤口和角膜炎中抗感染和促愈两大难题,成功构建出具有主要强力抗多重耐药菌兼具间接促愈合作用的三角形银纳米颗粒,主要强力促愈合兼具一定抗多重耐药菌作用的超小尺寸硫化铜纳米点,以及同时具有抗多重耐药细菌和促愈合双重强力功效的金银氧化亚铜复合纳米壳。三种纳米材料均协同近红外激光进行光热治疗,对周围正常组织、血液和主要脏器无明显毒副作用,以上具有抗菌促愈合双重功效纳米治疗系统为临床上应对慢性难愈合伤口和角膜炎的治疗提供了一种富有临床转化前景的候选方案。