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目的:探究IL-Y在慢性移植物抗宿主病中的作用及其机制研究。方法:1、克隆小鼠IL-27p40和IL-12p28基因,并通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠IL-27p40和IL-12p28基因,构建IL-Y单链融合基因,在其5’端添加Igκ信号肽和Nhel Ⅰ酶切位点,在其3’端添加Flag标签和Sal Ⅰ酶切位点,并将其连接至真核表达载体mini-circle中。通过酶切和DNA测序鉴定阳性重组载体。2、建立两种慢性移植物抗宿主病(cGVHD)小鼠模型。(1)C57BL/6-BALB/c模型:14只6-8周龄BALB/c(H2Kd,♀)受体鼠随机分为2组,每组7只:实验组通过尾静脉高压水流动力学的方法(HGT)注射120ug/2ml IL-Y真核表达质粒(mini-IL-Y),对照组注射120ug/2ml空载质粒(mini-circle)。两组BALB/c受体鼠在HGT24小时后分别接受650cGy清髓性辐照。4小时后通过尾静脉注射的方法输注C57BL/6(H2Kb,♀)的骨髓细胞(5×106/只)和全脾细胞(1×106/只)诱导cGVHD;(2)DBA/2-BALB/c模型:14只6-8周龄BALB/c(H2Kd,♀)受体鼠随机分为2组,每组7只:实验组通过尾静脉高压水流动力学的方法(HGT)注射120ug/2ml IL-Y真核表达质粒(mini-IL-Y),对照组注射120ug/2ml空载质粒(mini-circle)。两组BALB/c受体鼠在HGT24小时后分别接受650cGy清髓性辐照。4小时后通过尾静脉注射的方法输注DBA/2(H2Kd,♀)的骨髓细胞(7.5×106/只)和CD25-脾细胞(4×107/只)诱导cGVHD;3、观察两种模型下小鼠生存和体重变化,记录cGVHD评分;移植后每周检测小鼠尿蛋白水平;检测移植后8周小鼠血清抗ds-DNA抗体水平;4、移植后第八周留取小鼠肾、皮肤、肝、肺、小肠、唾液腺进行组织病理学检查;5、小鼠造模8周后,采用流式细胞术检测移植小鼠脾脏中CD4、CD8、CD44、CD62L细胞的比例,调节性T细胞(Treg)、滤泡辅助性T细胞(Tfh)的比例以及B细胞、滤泡B细胞(follicular B cell)、生发中心B细胞(germinal center B cell)、边缘区B细胞(marginal zone B cell)及浆细胞(plasma cell)的比例;同时,检测脾B细胞表面共刺激分子CD40、CD86、MHC-II类分子的表达;通过胞内染色检测移植后8周脾脏及肝脏中CD4+T细胞分泌的IL-4、IL-17A、IFN-γ、TNF-α以及CD8+T细胞分泌的IL-4、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平;另外,检测肺脏B细胞、滤泡B细胞(follicular B cell)、生发中心B细胞(germinal center B cell)、边缘区B细胞(marginal zone B cell)及浆细胞(plasmacell)的比例。6、CBA检测移植后8周血清中IL-2、IL-4、IL-17A、IL-21、IFN-γ、TNF-α细胞因子水平;结果:1、成功构建了IL-Y真核表达载体,并通过酶切及DNA测序鉴定阳性重组载体;另外,通过免疫组化及western blot证明IL-Y在小鼠肝脏过表达;2、成功构建了2种小鼠cGVHD模型:C57BL/6-BALB/c cGVHD模型和DBA/2-BALB/c cGVHD模型;3、移植后检测尿蛋白发现IL-Y组小鼠尿蛋白水平明显升高,血清抗dsDNA抗体水平也明显升高;另外,移植后IL-Y组小鼠体重较对照组也明显减轻;4、在两种模型中,移植后8周IL-Y组肝脏中的炎症细胞浸润、细胞水肿明显及肝小窦间隙明显缩小;肾脏正常肾小球结构明显减少,肾小球结构破坏、炎症细胞明显增加。皮肤中的真皮纤维化、脂肪丢失、炎症及表皮界面变化较对照组明显加重;肺脏中支气管和肺泡结构破坏、炎症细胞浸润明显增加;空肠中的炎症细胞浸润、凋亡体、绒毛结构破坏及隐窝丢失明显增加;唾液腺腺体明显萎缩硬化,淋巴细胞浸润明显增加,其病理评分2组有统计学差异;5、流式细胞仪检测IL-Y组小鼠脾淋巴细胞中效应CD4+T(CD44+CD62L-)和效应CD8+T细胞明显升高,CD4+T的初始T细胞(CD44-CD62L+)与CD8+T的初始T细胞的比例则显著减少;同时,IL-Y组Treg细胞比例明显低于对照组。虽然,IL-Y组Tfh细胞百分比及数量较对照组无明显差异,但其ICOS+Tfh细胞亚群比例明显升高。对B细胞分化影响,发现IL-Y组脾淋巴细胞中总B细胞、生发中心B细胞及浆细胞比例及数量均明显升高,肺淋巴细胞中生发中心B细胞、边缘区B细胞及浆细胞比例明显升高;同时,脾B细胞表面共刺激分子CD86和MHC-II表达明显升高。胞内染色发现,脾淋巴细胞及肝脏淋巴细胞中分泌TNF-α的CD4+T细胞和CD8+T细胞也明显高于对照组。6、CBA检测移植后小鼠8周血清发现,IL-Y组小鼠血清中TNF-α水平明显升高。结论:IL-Y能促进cGVHD的病理进程,其主要机制是通过促效应T细胞比例及数量,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞TNF-α的分泌,提高Tfh细胞促进B细胞分化为生发中心B细胞、浆细胞能力,以及提高B细胞产生自身抗体的能力等共同发挥作用。