海绵共附生微生物筛选及其放线菌抗菌活性物质分离纯化

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海绵共附生微生物作为海洋天然产物的重要来源,越来越受到重视。本论文筛选深海海绵共附生微生物,分离纯化其中放线菌抗菌活性化合物,旨在丰富微生物物种多样性,发现更多有潜力、有活性的天然产物。从南海和西太平洋深海的海绵中筛选共附生微生物,采用11种培养基从18个海绵样品中共获得48株海绵共附生微生物,其中细菌34株(16个属),放线菌10株(5个属),真菌4株(2个属)。根据微生物多样性发现,细菌、放线菌和真菌中占比最高的属分别是芽孢杆菌属(25%),链霉菌属(8.33%)和曲霉菌属(6.25%)。分析微生物来源发现网线海绵科(Pheronematidae)平均筛得的微生物数量最多,偕老同穴科(Euplectellidae)分离获得的微生物最少,且M1和MEA培养基分别对海绵共附生放线菌和真菌的分离具有较好效果。对所有微生物进行抑菌活性初筛,发现10株放线菌中3株具有抗菌活性,其中菌株Streptomyces sp.2-7对革兰氏阳性菌抑菌活性最强。分离纯化活性大且稳定的Streptomyces sp.2-7的活性化合物,确定最佳发酵时间是10 d,发酵液经等量石油醚萃取后再用等量乙酸乙酯萃取,粗提物通过葡聚糖凝胶(LH-20)、反相硅胶柱层析(RP-18)、高效液相色谱(HPLC)和薄层层析(TLC)等分离获得2个天然产物,其中化合物G-2为放线菌素D,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)芽孢具有强抑制活性,且含量较高,达到373.5 mg/L。此外,通过分析调控相关基因和启动子,发现G-2的高产量受多种因素调控,可能与调控基因数量和强启动子有关,为后续基因改造及海洋放线菌底盘细胞的构建提供良好载体。以共培养、寡营养培养和不同培养基3种方式对无活性或弱活性的微生物进行次级代谢产物活性的激活。其中,不同培养基培养成功激活菌株Streptomyces sp.2-85产生不同的次级代谢产物,激活后的菌株Streptomyces sp.2-85对大肠杆菌和寄生水霉均表现出较强且稳定的抑菌活性。为获得有效的抗寄生水霉化合物,对Streptomyces sp.2-85的活性化合物进行初步分离,摸索最适培养条件和最佳萃取条件后获得粗提物,经孵育实验和半制备液相色谱判断活性组分出峰时间,并利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)和分子网络(MN)进行化合物预测,最后大量制备获得分子量为489.30854的活性化合物X-1,结果显示该物质为新型化合物。
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