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第一部分:大豆苷元在小鼠自身免疫性肝炎中的保护作用及其机制研究目的:ConA诱导的肝损伤是研究自身免疫性肝炎的经典模型,本研究探讨大豆苷元对ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝炎的保护作用,并进一步探讨其对肝细胞的影响及可能的机制。方法:1、体内实验称取体重22~24g的雄性C57BL/6J小鼠,尾静脉注射刀豆蛋白A(ConA)构建小鼠自免肝模型。实验小鼠分为四组:对照组(Ctrl),尾静脉注射与ConA等剂量的生理盐水;Daid组,腹腔注射大豆苷元(200mg/kg/d),连续打三天;ConA组,尾静脉注射ConA(15mg/kg);ConA+Daid组,腹腔注射大豆苷元(200mg/kg/d),连续打药三天后尾静脉注射ConA(15mg/kg)。首先,按照25mg/kg ConA剂量构建致死性免疫性肝炎模型,观察并记录ConA组和ConA+Daid组72小时后的生存率。然后,按照15mg/kg剂量建立可逆性自身免疫性肝炎模型,12小时后收集小鼠血清标本,分别检测ALT、AST和TNF-α、IL-1β、IL-6水平以反映肝功能及炎性因子表达情况;获取各组小鼠肝脏,肉眼观察肝脏的颜色及大小,H&E染色观察肝脏病理变化并进行Suzuki评分,Cleaved caspase-3和TUNEL染色观察肝细胞凋亡;获取肝组织冰冻切片进行DHE染色及SOD、GPX和MDA活性检测观察肝脏组织中氧化应激损伤;提取肝组织RNA,检测肝内炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA表达水平;提取肝组织蛋白,Western blot检测Akt/GSK-3β/Nrf2信号通路及下游HO-1、NOQ1蛋白的表达情况;提取肝脏单个核细胞和脾脏淋巴细胞,分别标记CD3、CD4和D69,流式检测各组中CD4+T细胞浸润及活化情况;2、体外实验将AML-12细胞系进行体外培养,在不同浓度大豆苷元作用下给予ConA刺激12小时后,分别用CCK-8和流式检测AML-12细胞的活力及凋亡情况。结果:1、体内实验在致死剂量下,ConA组小鼠注射ConA后6小时开始死亡,72小时内存活率仅40%,而ConA+Daid组注射ConA后72小时内存活率为100%,与ConA组比较具有明显的统计学差异(P<0.01)。给小鼠尾静脉注射非致死剂量ConA后,12小时后获取小鼠血清、肝脏标本。结果发现,对照组及Daid组肝脏表面光滑,颜色红润;ConA组小鼠肝组织呈黑红色,肿胀变大,肝脏表面有散在出血点;而ConA+Daid组肝脏表面光滑柔软,颜色淡红,未见明显肿胀。各组小鼠血清检测,对照组和Daid组肝酶在正常水平,无统计学差异。ConA组ALT、AST水平明显升高,而ConA+Daid组小鼠ALT、AST水平较ConA组明显下降(P<0.001)。肝脏H&E可见正常对照组及Daid组肝细胞形态正常,小叶结构清晰;ConA组小鼠肝组织大片状坏死灶,肝细胞核碎裂或消失,肝小叶结构紊乱,并伴有大量炎性细胞浸润;而ConA+Daid组小鼠肝脏无明显坏死,小叶结构大致清晰,少量炎性细胞浸润,肝脏Suzuki评分差异明显(P<0.01)。同时,肝组织Cleaved caspase-3免疫荧光染色及TUNEL染色提示ConA组肝细胞凋亡明显增多,而ConA+Daid组肝细胞凋亡明显降低(P<0.001)。q RT-PCR检测ConA组小鼠肝内炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA表达明显升高,而ConA+Daid组小鼠肝内上述炎性因子水平较ConA组明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05 or P<0.01)。ELISA试剂盒检测各组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,与ConA组相比,ConA+Daid组炎症因子的含量也明显降低,与q RT-PCR结果基本一致。氧化应激损伤指标检测,肝脏DHE染色显示,ConA组ROS含量明显高于ConA+Daid组(P<0.01),并且ConA组肝脏中SOD(P<0.05)、GPX(P<0.05)活性与ConA+Daid组相比也明显降低。不仅如此,ConA+Daid组肝脏中MDA(P<0.01)活性较ConA组也明显降低。我们进一步提取肝脏组织蛋白,进行Western blot检测。结果显示,与ConA组相比,ConA+Daid组中Nu-Nrf2(P<0.05)、HO-1(P<0.01)、NOQ1(P<0.01)以及p-Akt(P<0.01)、p-GSK-3β(P<0.01)水平均明显增高。肝脏单个核细胞和脾脏淋巴细胞流式结果提示,大豆苷元并不能抑制ConA刺激引起的CD4+T细胞的激活。2、体外实验大豆苷元能减轻ConA诱导的AML-12细胞凋亡(P<0.01),并且这种保护效应能被磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路抑制剂LY294002削弱。结论:1、大豆苷元能减轻ConA诱导的小鼠急性自身免疫性肝炎肝损伤;2、大豆苷元能减轻ConA诱导的氧化应激损伤及肝细胞凋亡;3、大豆苷元对ConA诱导的肝损伤的保护作用可能是通过调节Akt/GSK-3β/Nrf2信号通路来实现的。第二部分:大豆苷元在小鼠肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制研究目的:大豆苷元是一种大豆异黄酮,研究表明大豆苷元在脑和心肌缺血再灌注损伤中具有良好的保护作用。然而,大豆苷元预处理是否也能减少肝缺血再灌注(I/R)损伤尚不清楚。本研究旨在探讨大豆苷元在肝I/R损伤中的保护作用及其可能的机制。方法:1、体内实验称取体重22~24g的雄性C57BL/6J小鼠,构建70%部分肝缺血再灌注损伤模型(32℃缺血1小时,再灌注6小时)。实验小鼠分为四组:(1)假手术组(Sham组):仅剪开腹腔后再行缝合,不做缺血造模处理;(2)模型组(H/R组):给予70%部分肝缺血再灌注损伤造模处理;(3)保护组(H/R+Daid):70%部分肝缺血再灌注损伤造模处理前,连续三天每天予以腹腔注射大豆苷元(200mg/kg/d)。(4)重组HMGB1组(H/R+Daid+r HMGB1组):连续三天每天予以腹腔注射大豆苷元(200mg/kg/d),然后行70%部分肝缺血再灌注损伤造模,开放的同时给予重组HMGB1(20ug/只)。再灌注6小时后收集各小组小鼠血清,检测ALT和AST水平观察肝功能变化。收集再灌注6小时后小鼠肝脏组织标本,固定后行TUNEL染色观察肝细胞凋亡,H&E和MPO染色观察肝脏病理变化和中性粒细胞浸润。收集再灌注6小时后肝脏标本,冻存于-80℃冰箱中,提取肝脏组织RNA,q RTPCR检测肝内TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子及Bax、Bcl-2凋亡基因的转录水平。获取再灌注0、1小时后肝脏标本及再灌注6小时小鼠血清标本,分别行HMGB1免疫组化染色、胞浆蛋白Western blot及血清ELISA检测再灌注0、1小时及再灌注6小时后,肝脏和外周HMGB1的释放情况。提取再灌注6小时后肝脏组织总蛋白,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及其磷酸化蛋白的表达情况。2、体外实验将AML-12小鼠肝脏细胞系进行体外培养,在大豆苷元作用下给予Cocl2(300u M)刺激24小时后,分别用流式检测AML-12细胞凋亡,免疫荧光和胞浆蛋白Western blot检测HMGB1释放情况。结果:1、体内实验再灌注6小时后,H/R组小鼠血清ALT、AST水平较Sham组明显上升,而H/R+Daid组小鼠血清ALT、AST水平较H/R组明显下降,具有明显的统计学差异(P<0.001)。肝脏标本H&E染色显示,H/R组小鼠肝脏组织出现大面积缺血坏死灶,肝细胞肿胀或变性,并伴有大量的炎性细胞浸润以及小叶结构紊乱;H/R+Daid组仅见少量肝细胞空泡样变性,但无明显坏死,炎性细胞浸润较模型组明显减少,Suzuki’s评分(P<0.01)用于评估肝脏病理损伤程度,其结果也证实了这一点。同时,TUNEL染色结果显示H/R+Daid组肝细胞凋亡较H/R组明显减少,q RT-PCR和Western blot检测Bax、Bcl-2,与H/R组相比,H/R+Daid组促凋亡基因Bax表达明显下调,而抑凋亡基因Bcl-2表达明显上调(P<0.05),这些结果也提示大豆苷元能明显减轻肝细胞凋亡。另外,q RT-PCR及肝脏MPO染色显示,H/R组肝脏炎性因子表达水平及中性粒细胞浸润均较Sham组升高,给予大豆苷元预处理能明显降低小鼠肝脏炎性因子表达水平及中性粒细胞浸润,差异具有统计学意义(TNF-α,P<0.01;IL-1β,P<0.001;IL-6,P<0.05)。小鼠肝脏再灌注0、1小时的免疫组化及胞浆蛋白Western blot结果显示,大豆苷元能够明显减少小鼠肝脏缺血引起的HMGB1核浆迁移情况(P<0.01)。同时,血清ELISA结果也显示,大豆苷元预处理能减少再灌注阶段HMGB1向外周的释放(P<0.01)。此外,我们检测了再灌注6小时后小鼠肝脏组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及其磷酸化蛋白的表达情况,结果显示,与H/R组相比,H/R+Daid组中TLR4、MyD88、p-NF-κB表达明显降低(P<0.05)。为了进一步验证大豆苷元是否通过抑制HMGB1释放来发挥保护作用,我们在再灌注的同时给予重组HMGB1,结果发现,给予外源性重组HMGB1后,大豆苷元对肝组织损伤的保护作用明显减弱。2、体外实验大豆苷元能明显减轻Cocl2引起的AML-12细胞凋亡(P<0.01)及HMGB1核浆迁移(P<0.05)。结论:1、大豆苷元能减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤;2、大豆苷元能减少肝脏缺血再灌注损伤引起的肝细胞凋亡及炎症因子的释放;3、大豆苷元能减少肝脏缺血再灌注损伤引起的HMGB1释放,调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,从而减轻肝缺血再灌注损伤。