MicroRNAs(miRNAs)是一类小的,含有大约19-24个核苷酸的非蛋白质编码的RNA分子,它在各种生物过程、基因表达的调控中起着极其重要的作用。大量的数据表明,miRNA的表达失调与人类多种疾病之间存在着密切的关系,从而使特异性miRNA成为诊断、预后以及治疗相关疾病的高潜力生物标志物,所以发展一种灵敏度高、选择性好的原位miRNA的检测方法具有极其重要的意义。催化发夹组装(CHA)技术是近年来提出的一种免酶且恒温的核酸信号放大技术,已经被用于细胞内RNA的检测,但是其在细胞内的应用面临两个难题,一方面,探针很难自主的进入细胞,另一方面CHA的反应较慢。本文基于CHA设计了一种局域化催化发夹组装技术(LCHA),该技术能很好地突破CHA所带来的局限性,并且设计了两种检测细胞内miRNA的方法,具体内容如下:(1)以单链的DNA为材料,构建了一种DNA骨架用于细胞内相关miRNA的超灵敏检测。将能发生CHA反应的两个发夹探针H1、H2(发夹H1是在适当位置用FAM和BHQ 1标记的自猝灭发夹结构)交替连接在DNA骨架上,该DNA骨架会通过胞吞的形式自主进入细胞,从而将发夹探针带入到细胞内。当目标物存在时,它会首先打开发夹H1,H2的粘性末端会和H1发生杂交,从而把目标物置换下来,此时H1上的FAM和BHQ1会彼此远离,荧光恢复。由于DNA骨架上含有很多H1和H2,所以会同时触发多个CHA,该反应即为LCHA,LCHA的检测限比CHA低约1个数量级,并且LCHA提高了发夹的局部浓度,因此使得其反应的速率较快。此外,该DNA骨架构成的DNA纳米探针能够检测细胞内miRNA的动态变化,所以可以作为一种简单而有效的办法用于细胞内miRNA的基础研究。(2)在上一个工作中,我们提出的LCHA虽然可以加快反应速率,但是其假阳性信号也会升高,基于此,我们将荧光共振能量转移(FRET)与LCHA结合,用来有效的避免假阳性信号。以单链的DNA为材料,构建了一种DNA四面体用于细胞内相关miRNA的超灵敏检测。将能发生CHA的一对发夹探针H1和H2(H1是在适当位置用FAM标记的发夹结构,H2是在适当位置用TAMRA标记的发夹结构)分别连接在DNA四面体上,DNA四面体会通过胞吞的形式进入细胞,从而将发夹探针带入到细胞内。当目标物存在时,它会首先打开发夹H1,H2的粘性末端会和H1发生杂交,从而把目标物置换下来,此时发夹H1和H2会杂交形成一段DNA双链,使得标记在H1上的FAM荧光基团和标记在H2上的TAMRA荧光基团彼此靠近,产生明显的FRET信号,同时,置换下来的目标物可以触发新一轮CHA,从而可以达到目标物放大检测的目的。