论文部分内容阅读
目的线粒体的功能取决于线粒体的膜系统,而线粒体内膜的形态由近期发现的线粒体接触位点复合物(MICOS)所调节,MICOS的突变可改变嵴的形成,导致线粒体功能障碍。本文利用慢病毒shRNA靶向敲低MICOS复合物(Mic19/CHCHD3及Mic60/mitofilin)表达,并研究敲低线粒体内膜蛋白(Mic19、Mic60)对肝癌细胞相关生物学作用的影响。方法由NCBI数据库查找线粒体内膜蛋白Mic19及Mic60序列,设计针对Mic19的 shRNA Mic19-1、shRNA Micl9-2 及 Mic60 的 shRNA Mic60-1、shRNA Mic60-2的重组慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293 T细胞中,包装产生病毒,再用包装后的病毒感染HepG2细胞,收集用嘌呤霉素筛选后的阳性细胞,并以空白组、空载pLKO.l慢病毒质粒组作为对照。采用蛋白印迹法检测Mic19及Mic60蛋白的表达,以筛选敲低效率最高的稳定细胞株。采用MTT法、蛋白印迹法、Wound healing和Transwell检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭情况,观察敲低Mic19及Mic60表达对肝癌细胞生物学行为的影响。结果Micl9敲低组肝癌HepG2细胞蛋白相对表达量shRNAMic19-l(0.579±0.042)和shRNA Mic19-2(0.524±0.111)均低于空白组和空载组,P<0.01。Mic60敲低组蛋白相对表达量 shRNAMic60-l(0.172±0.107)、shRNAMic60-2(0.269±0.027)明显低于对照组,P<0.0l。蛋白印迹实验表明,Mic19敲低组caspase3(1.34±0.145)、caspase9(1.209±0.173)蛋白相对表达量均显著高于空白组(0.652±0.089)和空载组(0.671±0.023),差异有统计学意义,P<0.01;Mic60敲低组caspase3(1.453±0.151)、caspase9(1.057±0.11)蛋白相对表达量均显著高于空白组(0.45±0.033)和空载组(0.471±0.183),差异有统计学意义,P<0.01。生长曲线表明,Mic19敲低组至感染第36 h时的吸光度(absorbance,A)值低于对照组,P<0.05;Mic60敲低组至感染第12h时的A值显著低于对照组,P<0.01。划痕实验表明,至第48hMic19敲低组细胞迁移距离为(286.8±38.97)μm,Mic60敲低组细胞迁移距离为(214.6±41.64)μm,与对照组相比差异均有统计学意义,P<0.01。在不铺胶的迁移实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(440.4±65.35)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(235.2±21.3)个/低倍视野,均少于对照组,P<0.01。在铺胶的侵袭实验中,Mic19敲低组穿膜细胞数为(172.4±15.5)个/低倍视野,Mic60敲低组穿膜细胞数为(118.2±25.53)个/低倍视野,均少于对照组,P<0.01。结论重组慢病毒shRNA Mic19-2、shRNA Mic60-1可分别有效敲低HepG2细胞Mic19、Mic60的表达。慢病毒shRNA靶向敲低Mic19及Mic60表达可抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进HepG2细胞的凋亡能力,并为后续进一步研究线粒体内膜蛋白(Mic19、Mic60)对肝癌细胞发生发展的影响提供依据。