白血病为造血干细胞功能紊乱，可引起患者出血、淋巴肿大、骨骼疼痛等症状的恶性克隆性疾病。白血病在我国发病率较高，并有逐年增长趋势。成人T细胞白血病(adultT-cell leukemia，ATL)作为一种特殊类型的淋巴白血病，是与人类T细胞白血病病毒1(human T cell leukemia/lymphoma virus，HTLV-1)感染有关、发生于成人体内的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，严重威胁人类健康。目前，ATL的常见治疗方法如结合化疗、分子靶向药物、异基因骨髓干细胞移植等，因其存在毒副作用大、特异性差、有并发症等不足，使得白血病患者的治愈情况不容乐观，且预后效果极差，因此，寻找新的治疗方法尤为必要。　　光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)为氧气依赖型的光活化作用物理疗法，因具有创伤小，特异性高，并发症少，能保护容貌等优点，被应用于肿瘤的治疗中。传统光敏药物血卟啉等衍生物（haematoporphyrin derivative，HPD），因易发生机体过敏，皮肤细胞中代谢速率较缓等不足而达不到根治肿瘤效果。金丝桃素(Hypericin，HYP)作为光动力疗法的新型光敏药物，是从天然草药贯叶金丝桃(Hypericu-mperforatum L.)中提取的最具生物活性的萘苯二蒽酮类化合物，具有暗毒性低、光毒性强，对肿瘤选择性强而作用健康组织损伤小等优势。近年来还发现金丝桃素具有明显的抗病毒作用。目前HYP的光学性质已得到了深入的研究，有些已经应用于临床并取得可观的科研成果与医学效果，具有非常广阔的PDT临床应用前景。然而目前，国内外大多数关于HYP作为光敏剂介导的PDT疗法(HYP-PDT)研究主要局限于食道癌，皮肤癌，肝癌，大肠癌等实体瘤方面，有关白血病方面的研究还相对较少，且具体杀伤机制尚未明确。本研究以HTLV-1病毒感染的ATL细胞和未感染的白血病细胞为实验对象，通过体外实验研究金丝桃素对白血病细胞的增殖抑制作用，同时分析其具体分子作用机制，为白血病的治疗以及金丝桃素的进一步开发利用提供一定的理论依据和实验基础。主要内容如下:　　第一部分:光敏化金丝桃素对多种白血病细胞具有极明显的生长和增殖抑制作用　　首先，一定药物浓度的HYP配合光照作用多种白血病细胞24 h后，MTT法检测细胞生长活力并计算分析半致死浓度(IC50)。数据表明，单独的光照或金丝桃素作用下，OD值无明显变化;而光活化的金丝桃素作用细胞后，随药物浓度加大，OD值逐渐变小，即可以反应出细胞生长活力受到抑制。统计分析可知，光活化金丝桃素作用ATL-T、MT-2、C8166、TL-Om1、Molt4、Jurkat、Hut78细胞株的IC50分别为:52.98、52.86、43.02、37.88、32.26、18.16、11.12 ng/mL。综上结果表明，光敏化金丝桃素对多种白血病细胞皆具有极明显的小剂量杀伤作用，并呈现出浓度依赖效应。　　然后平板克隆形成实验进一步检测HYP-PDT对细胞增殖的影响，结果表明，光活化金丝桃素处理ATL-T细胞后，实验组克隆形成率明显降低。　　第二部分:HYP-PDT引起细胞凋亡，周期阻滞　　为了观察HYP-PDT对细胞形态的影响，不同药物浓度的HYP光激活后作用ATL-T和TL-Om1细胞24 h，显微镜观察显示，随HYP浓度加大，细胞开始皱缩、变圆缩小，数量减少，并出现凋亡小体。进一步用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染ATL-T细胞，发现随药物浓度的增加，细胞从贴壁的梭形开始变圆脱落，视野内橘黄色荧光增多。以上结果表明HYP-PDT能够引起细胞形态变化，诱导细胞发生凋亡。　　光活化后的HYP作用ATL-T细胞24 h，AnnexinⅤ/PI荧光双染色流式细胞仪分析发现，100 ng/mL的HYP可使26.16％的ATL-T细胞发生凋亡，200 ng/mL的HYP让凋亡比率提升至50.05％，400 ng/mL的HYP甚至可使97.04％的细胞发生凋亡。30，50，100ng/mL HYP作用TL-Om1细胞24 h，结果发现实验组细胞凋亡率分别为20％，54％，93％。以上结果提示，HYP可以显著诱导ATL细胞发生凋亡。　　此外，流式细胞术分析显示光活化的金丝桃素引起TL-Om1和ATL-T细胞在G2/M期滞留，Western blot实验表明HYP-PDT处理后细胞内CyclinB1含量的增高可能与G2/M期滞留相关。　　第三部分:HYP-PDT引起细胞凋亡机制探究　　为了探究HYP-PDT引起ATL细胞凋亡的分子机制。首先运用Caspase广谱型抑制剂Z-VAD-FMK处理ATL细胞后，MTT法检发现Caspase抑制剂能显著减弱HYP引起的细胞的杀伤作用，然后进一步利用Western blot蛋白印迹法检测Caspase蛋白家族表达情况，结果表明HYP明显引起Caspase-3，-7，-9蛋白表达水平下调，并出现激活型的蛋白剪切带。细胞凋亡多数涉及线粒体的损伤，因此我们利用JC-1染色流式上机分析了光活化金丝桃素对ATL细胞线粒体膜电位的影响。结果发现，在终浓度50，100，200 ng/mL光活化HYP作用ATL-T细胞24 h后，线粒体膜电位下降比率分别为12.27％，27.42％，52.52％。同样明显的变化趋势也出现在HYP-PDT作用的TL-Om1细胞中，即10，20，30 ng/mL HYP作用可引起TL-Om1细胞线粒体膜电位下降比率分别为4.53％，28.47％,55.88％。　　进一步用蛋白免疫印迹检测凋亡通路有关蛋白。显影结果表明，促凋亡蛋白Bax，Bad，AIF蛋白表达量上调，Bid出现明显剪切活化带，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显下调以及细胞色素C蛋白丰度变高;P53蛋白表达上调且P53蛋白磷酸化（ser-15位）水平降低，PARP蛋白表达下调并出现激活型切割带;并进一步利用报告基因实验分析Bax启动子活力以及P53转导通路是否激活，结果发现金丝桃素能够明显引起Bax基因启动子活力上升，P53凋亡信号通路被明显激活。　　以上结果提示，金丝桃素光动力作用通过引起凋亡相关蛋白表达异常以及凋亡信号通路激活，诱导ATL细胞发生凋亡。　　第四部分:金丝桃素光敏化作用能够抑制HTLV-1关键致病基因的表达　　为了研究金丝桃素是否通过影响引起白血病的病毒基因表达来抑制细胞增殖，我们运用PCR检测细胞中Tax、HBZ的表达，结果显示;金丝桃素处理后，ATL-T和TL-Om1细胞中HBZ表达均有下调，而Tax表达无明显变化。同时我们通过细胞转染3-LTR-Luc质粒（病毒基因编码的片段），荧光素酶报告基因分析启动子活性，结果显示:金丝桃素处理组病毒基因片段3-LTR-Luc表达下调。为了进一步验证金丝桃素对病毒的影响，我们将ATL-T细胞（HBZ、Tax阳性）与Jurkat细胞（HBZ、Tax阴性，转染了WT-Luc质粒）共培养，报告基因检测结果显示:WT-Luc表达下调。以上结果提示，金丝桃素能够引起HTLV-1病毒编码基因的表达下调从而抑制ATL细胞的生长。　　综上所述，本研究证实光活化金丝桃素通过引起细胞凋亡、周期阻滞以及抑制病毒基因表达，从而抑制白血病细胞的增殖。本课题将为金丝桃素的开发利用以及白血病的治疗提供一定的实验基础，也为未来成人T细胞白血病的临床治疗提供一个全新的思路与策略。