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自噬,即“自我吞噬”,指在一些应激条件下,细胞内待降解的蛋白质、胞器或其它内容物被双层膜囊泡包裹形成自噬体,进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体,以此满足细胞新陈代谢的稳定、相应细胞器的更新及物质的循环再利用。传统观念认为,自噬是一种细胞的适应性反应;然而,越来越多的研究发现,自噬的结果还表现为另一种形式,即自噬性细胞死亡,也叫做Ⅱ型程序性死亡。线粒体是真核细胞的“动力工厂”,调控细胞的命运。首先,线粒体内含有多种细胞凋亡相关蛋白参与细胞凋亡过程的调控。其次,线粒体是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的主要来源,而且ROS在细胞自噬的调控过程中起到重要的角色。因此本研究着重探讨线粒体在电离辐射诱导的人肿瘤细胞自噬性死亡中的作用。目的以人宫颈癌细胞He La和人乳腺癌细胞MCF 7、MDA 231为研究对象,探讨线粒体在辐射诱导的自噬性细胞死亡中的作用。方法(1)细胞株:本研究选用人宫颈癌细胞He La和人乳腺癌细胞MCF 7、MDA 231为研究对象;(2)照射条件:采用X-RAD 320ix辐照仪进行照射,电压180 k V,电流20 m A,滤板2 mm Al,单次源靶距70 cm,剂量率1.0 Gy/min;(3)检测指标:MTT染色法检测细胞存活率;蛋白水平表达采用蛋白免疫印迹分析;Mito-Tracker Green荧光探针检测线粒体膜完整性;ROS水平、自噬水平及线粒体膜电位采用流式细胞术检测。(4)数据分析:采用SPSS软件进行统计学分析,试验中的数据采用均数±标准差(`x±s)表示,均值比较采用t检验,p<0.05被认为差异有统计学意义。统计图采用Origin 8.0软件制作。结果1.电离辐射诱导He La、MCF 7及MDA 231细胞发生自噬性死亡分别给予He La、MCF 7及MDA 231细胞8 Gy照射剂量,MTT结果显示,与0 Gy组相比,三种细胞8 Gy照射后24 h,48 h,72 h细胞存活率均明显下降;与单纯照射所引起的细胞存活率下降相比,加入自噬抑制剂CQ、3-MA后,辐射诱导的细胞死亡均受到显著抑制;8 Gy照射后6 h,12 h,24 h,48 h检测自噬相关蛋白MAPLC3的表达水平,结果显示,照射后MAPLC3Ⅱ/MAPLC3Ⅰ比值均明显增加;另外,在三种细胞接受照射后Beclin 1的表达水平明显增加,p62的表达在两种乳腺癌细胞受照射后显著降低,以上结果提示辐射诱导He La、MCF7及MDA 231细胞发生自噬性死亡。2.ROS参与调控辐射诱导的He La、MCF 7及MDA 231细胞自噬性死亡He La细胞中,与各组0 Gy相比,4Gy、8 Gy照射后4 h、12 h和24 h ROS水平均明显升高;在两种乳腺癌细胞中电离辐射后12 h和24 h,ROS也显著增加。NAC作为一种抗氧化剂,起到清除ROS的作用,且在三种肿瘤细胞中均降低了辐射诱导的ROS水平;MDC染色检测自噬率结果显示,NAC显著降低了辐射诱导的自噬,结果提示,ROS介导电离辐射诱导的自噬。在He La细胞中,采用磷酸钙转染成功构建SOD2-Ri细胞模型,8 Gy照射后检测ROS的水平、自噬率和细胞存活率,结果显示,SOD2-Ri细胞中ROS、自噬率和细胞死亡率均较p SUPER细胞高,以上结果提示ROS介导辐射诱导的自噬性细胞死亡。3.抗氧化剂抑制电离辐射诱导的线粒体损伤在He La细胞中,与各组0 Gy相比,4 Gy、8 Gy照射后12 h和24 h线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)均明显降低;且在两种乳腺癌细胞中,电离辐射12 h和24 h后MMP的变化同He La细胞一致,结果表明电离辐射诱导线粒体的损伤;Mito-tracker Green荧光结果显示抗氧化剂NAC明显抑制了辐射诱导的线粒体损伤,提示抗氧化剂抑制了辐射诱导的线粒体损伤。4.线粒体在电离辐射诱导的自噬性死亡中的作用与单纯照射组相比,TTFA在本研究中作为线粒体损伤剂,明显促进了辐射诱导的线粒体损伤、ROS的水平、自噬率和细胞的死亡率,而加入线粒体保护剂Cs A显著逆转了以上结果。结果提示,线粒体参与辐射诱导的He La、MCF 7及MDA 231细胞自噬性死亡。结论1.电离辐射诱导人He La、MCF 7及MDA 231细胞自噬性死亡。2.电离辐射所引起的ROS增加及线粒体损伤在辐射诱导的人He La、MCF 7及MDA 231细胞自噬性死亡中发挥调控作用。