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背景:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是动脉的慢性炎症过程,其特征是修饰的低密度脂蛋白在血管壁沉积,导致动脉粥样硬化斑块的形成。它是心绞痛、心肌梗塞等急性心血管事件的主要原因。尽管动脉粥样硬化的临床诊断和治疗取得很大进展,但斑块形成的复杂过程给有效的诊断和治疗带来了巨大的挑战。特异性的诊断方法及高效的治疗手段成为动脉粥样硬化的研究热点。大量研究表明,巨噬细胞作为斑块中的重要成分,是影响斑块发展的重要调控靶点。巨噬细胞在吞噬大量修饰的低密度脂蛋白后转变为巨噬细胞源性泡沫细胞。泡沫细胞的迁移能力较低,大量滞留在内膜下,进而导致粥样斑块和坏死核心形成,炎症状态加剧,斑块持续发展。因此,促进泡沫细胞迁出有助于抑制斑块进展。组织因子途径抑制物(Tissue factor pathway inhibitor,TFPI)是组织因子介导的外源性凝血途径的生理性抑制剂。研究证实,TFPI对斑块发展的抑制作用与其下调血管内皮细胞活化、血管平滑肌细胞的增殖和迁移以及炎症因子的表达有关。研究显示,TFPIct32作为TFPI的C端肽段,具有类似TFPI抗动脉粥样硬化的作用,但是其具体作用机制未明。本课题组前期实验结果表明:TFPIct32处理后,ApoE-/-小鼠主动脉窦处斑块面积缩小,且斑块内巨噬细胞数量减少。其作用机制可能与斑块内巨噬细胞外迁有关。泡沫化巨噬细胞的过度聚集会驱动粥样斑块的发展。斑块中泡沫细胞的迁出增多有助于斑块的消退。综合前期实验以及文献报道,本研究拟在体外进一步观察TFPIct32对巨噬细胞源性泡沫细胞迁移能力的影响并初步探究其作用机制。目的:探究TFPIct32对巨噬细胞源性泡沫细胞迁移能力的影响及其作用机制。方法:实验所用细胞为Raw264.7鼠巨噬细胞,采用细胞增殖-毒性实验(CCK8)观察TFPIct32对巨噬细胞细胞存活率的影响。实验分为三组:即对照组(Control)、阴性对照肽组(TFPIs)以及实验组(TFPIct32)。首先构建泡沫细胞模型,采用50μg/ml氧化低密度脂蛋白(oxLDL)处理细胞24h。不同处理组分别加入纯培养基、TFPIct32(12.5nM)以及同等摩尔的阴性对照肽-TFPI的C端随机排列的氨基酸序列肽(TFPIs)24h后,采用Transwell实验和鬼笔环肽染色检测TFPIct32对巨噬细胞源性泡沫细胞迁移的影响;采用Western blot检测CCR7、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达水平;采用qPCR实验检测CCR7、ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIF、TNFα的mRNA水平。为了明确TFPIct32对巨噬细胞源性泡沫细胞迁移的影响是否与CCR7有关,采用siRNA转染技术建立CCR7敲低模型。实验分组如下:对照组、TFPIct32组、TFPIct32+siCCR7组,采用Transwell实验和鬼笔环肽染色观察CCR7敲低后,TFPIct32对巨噬细胞源性泡沫细胞迁移的作用是否受到影响。结果:1.CCK8实验结果表明:TFPIct32作用24h,0-12.5nM浓度的TFPIct32对巨噬细胞的存活率无明显影响,但是25nM浓度的TFPIct32导致细胞的存活率下降19.45%(P<0.01);12.5nM浓度的TFPIct32处理巨噬细胞后,0-24h未明显抑制巨噬细胞的细胞存活率,但是作用48h后会导致巨噬细胞的细胞存活率下降3.64%(P<0.01)。说明TFPIct32在一定浓度和时间范围内对细胞存活率没有影响。2.泡沫细胞模型构建成功。采用50μg/ml oxLDL处理巨噬细胞24h,对空白组和oxLDL处理组进行油红O染色。光镜下,空白组巨噬细胞内无红染颗粒,oxLDL处理组细胞质内红染颗粒较多,符合泡沫细胞特征,表明成功构建泡沫细胞模型。3.Transwell实验结果显示:与对照组相比,TFPIs组穿过小室的细胞数量统计无显著差异;TFPIct32组穿过小室的细胞数量增加146.94%(P<0.01)。鬼笔环肽染色实验结果显示:与对照组相比,TFPIs处理后的细胞荧光强度差异无显著性;TFPIct32组细胞荧光强度增强49.05%(P<0.05)。说明TFPIct32能够促进泡沫细胞的迁移。4.蛋白质免疫印迹实验(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time-PCR,qPCR)实验结果显示:TFPIs组CCR7的mRNA和蛋白的表达与对照组相比,差异无显著性。与对照组相比,TFPIct32组CCR7的mRNA和蛋白表达上调397.21%和72.28%(P<0.01)。为了明确CCR7在TFPIct32促进泡沫细胞迁移过程中起到的作用,采用siRNA转染技术建立CCR7敲低模型。Transwell实验结果显示:TFPIct32+siCCR7处理组与TFPIct32组相比,穿过小室的细胞数量相对减少26.04%(P<0.01)。鬼笔环肽染色实验结果表明:与TFPIct32组比,TFPIct32+siCCR7处理组荧光强度染色减弱28.19%(P<0.01)。说明TFPIct32可通过上调CCR7来促进泡沫细胞的迁移。5.TFPIs组粘附分子以及MIF和MCP-1等的表达与对照组相比,差异无显著性。与对照组比较,TFPIct32处理组ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达减少19.97%和46.42%(均P<0.01),且其ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达减少34.86%(P<0.01)和88.85%(P<0.01)。与对照组比较,TFPIct32处理组MIF和MCP-1的mRNA表达水平下降14.20%和29.02%(均P<0.01)。提示,TFPIct32下调粘附分子以及MIF和MCP-1的表达。6.TFPIs组炎症因子TNFα、IL-1β、IL-6等的表达与对照组相比,差异无显著性。与对照组比较,TFPIct32处理组TNFα、IL-1β、IL-6的分别水平减少53.99%(P<0.01)、21.84%(P<0.05)和47.79%(P<0.01)。提示TFPIct32下调TNFα、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达。结论:1.TFPIct32通过上调泡沫细胞表面趋化因子受体CCR7表达来促进泡沫细胞的迁移。2.TFPIct32下调泡沫细胞VCAM-1、ICAM-1、MIF、MCP-1以及炎症因子的表达。