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冠状动脉粥样硬化性心脏病是严重危害人类生命健康的心血管疾病。最初的治疗方式是使用经皮冠状动脉球囊扩张减轻病变部位的血管狭窄,增加血流通畅度。近年来最主要的治疗手段是将支架植入到发生动脉粥硬化的血管中,支撑血管和重建血运。然而,支架植入后发生的支架内再狭窄(In-stent Restenosis,ISR)和晚期血栓成为了这一技术最大的障碍。自1987年以来临床先后发展了包括药物洗脱性支架(Drug Eluting Stents,DES)、支架内再植入支架治疗术、冠状动脉内放射治疗等多种治疗手段。但所有的治疗手段都不能完全消除ISR,且可增加晚期血栓的发生率。研究发现,维持内皮的完整和正常功能可显著降低支架植入术后的血栓形成和再狭窄率。因此,促进支架表面再内皮化,被认为是下一代支架的发展方向。 目前促内皮化的研究主要分为两种:体内内皮化和体外内皮化。体内内皮化是对支架材料的表面进行修饰,诱导植入后内皮系细胞在材料表面的增殖和分化,行使正常功能形成类似健康血管的内膜层。在这一方面的研究中,报道最多的是CD34抗体支架。CD34抗体在循环血液中捕获到内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),EPCs在支架表面分化为内皮细胞并分泌生长因子促进支架上内皮层的快速形成,目前这一研究已经应用到临床实验并获得可喜的治疗效果。体外内皮化是在体外环境中将细胞种植于支架表面,预先形成内皮层增加置入后生物相容性,达到快速内皮化的目的。目前常用的是内皮细胞种植,但植入后存留时间短,细胞保留率低是仍需解决的问题。 在本研究中,拟从体内内皮化和体外内皮化两个方向出发,设计并制备了抗CD133抗体涂层在体捕获EPCs支架和体外种植不同VEGF表达量的内皮细胞种植支架,并经过动物实验,探索这两种方式促支架内再内皮化的初步机理,并检验其防止支架内血栓的形成和抑制支架内再狭窄的效果。 主要内容和结论如下: ①制备抗CD133抗体涂层支架并进行了体外评价。在本课题组的前期研究中已证明抗CD133抗体涂层有利于EPC的粘附,因此我们从新西兰大白兔骨髓中分离出EPCs,利用鼠尾胶原成血管实验证实抗CD133抗体可以有效促进EPCs的血管新生;使用超声雾化喷涂装置制备了涂覆均匀的抗CD133抗体涂层支架,并且涂层在扩张后保持完整稳定;通过体外实验评价抗CD133抗体涂层支架对EPCs的捕获能力,在静态环境中抗CD133抗体涂层支架捕获EPCs的能力显著高于明胶涂层支架和裸支架,在剪切应力为2.5dynes/cm2的流动环境中抗CD133抗体涂层支架捕获EPCs的能力显著高于抗CD34抗体涂层支架、明胶涂层支架和裸支架。 ②制备VEGF不同表达水平的内皮细胞种植支架并进行了体外评价。通过慢病毒介导建立VEGF121基因过表达(VEGF121++ECs)内皮细胞系、VEGF121基因干扰(VEGF121--ECs)内皮细胞系,及其两组空载体转染内皮细胞系;qPCR、Western Blot和ELISA试验证实过表达系和干扰系VEGF的表达的显著上调和显著下调;MTT法、划痕法和鼠尾胶原成血管实验证实VEGF121的过表达和降表达,分别促进和降低了内皮细胞的增殖效率、迁移水平和血管新生的能力;通过旋转培养装置制备细胞种植支架,支架上的细胞状态良好、生长旺盛,并且使用球囊扩张后仍有部分细胞牢固粘附。 ③通过动物实验,检验抗CD133抗体涂层支架和VEGF转基因细胞种植支架的内皮化效果和抗再狭窄能力。扫描电镜结果提示,这两类支架均能有效加快内皮化进程。其中抗CD133抗体涂层支架表面的内皮层的出现于一周内并且可能早于抗CD34抗体涂层支架,而VEGF干扰组支架效果稍弱,4周后仍未出现形态正常的内皮层,说明VEGF对内皮化进程有着重要的作用;12周后的硬组织切片结果显示,抗体涂层支架和细胞种植支架都达到显著的抗再狭窄效果。其中,抗CD133抗体涂层支架的内膜增生和管腔丢失显著低于明胶涂层支架和裸支架,与抗CD34抗体涂层支架相比未有显著性差异(p=0.07)。VEGF过表达细胞种植支架的内膜增生和管腔丢失也显著低于VEGF干扰细胞种植支架和裸支架,再狭窄率与抗CD133抗体涂层支架比较相对较低,统计分析结果P=0.06;为了分析支架上内皮层细胞来源,我们使用扫描电镜观察了0h样本中可以通过扫描电镜观察到少量种植细胞,但在此时及其后的样本中并未发现移植细胞的荧光表达,因此推测支架上内皮化的细胞几乎完全来源于宿主自体细胞。为了证明VEGF转基因细胞种植支架的安全性,我们对器官组织进行了冰冻切片,其中并未观察到表达荧光的转基因细胞,HE染色显示细胞与组织形态与正常组织一致。 本研究通过体内内皮化和体外内皮化两个思路,检验这两个方向对促支架内再内皮化的实际意义。制备了新型的抗CD133抗体涂层支架,与抗CD34抗体涂层支架对比,从体外和体内两方面验证两种抗体涂层支架其对于EPCs的捕获能力;通过对VEGF不同表达水平细胞的移植,探索VEGF在支架内再内皮化进程中发挥的作用。本研究将这两种方式在同一水平对比分析,为进一步的促血管新生治疗、血管新生机制及控制支架内再狭窄的研究奠定基础,同时也为组织工程寻找更有利的发展方向。