维生素A (vitamin A, VA)是儿童时期最重要的微量营养素之一,能保护皮肤和粘膜的完整性,调节机体的免疫功能。目前,VA缺乏仍然是影响我国儿童健康的重要因素之一,可导致儿童病毒感染性疾病的发病率和死亡率增高。本研究团队的前期研究已经证实：VA能维持免疫细胞的正常发育和功能活动,促进抗体的产生,从而提高机体的抗感染免疫力。但对于VA在抗病毒免疫方面的研究还有待深入。近年来,在我国部分地区出现了手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的爆发流行,且发病率呈逐年上升趋势,主要病原体为肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)。目前尚无针对EV71的疫苗或特异性治疗药物,主要依靠机体的抗病毒免疫力清除病毒,因此研究影响抗病毒免疫力的因素对于防治HFMD具有重要的临床意义。HFMD多发生于5岁以下婴幼儿,与VA缺乏处于相似的好发年龄段。另一方面,HFMD的典型病理损伤出现在皮肤和粘膜,而VA具有维护皮肤粘膜完整性的作用。因此,我们推测VA营养可能与儿童HFMD之间存在相互影响。鉴于以上原因,本研究将儿童HFMD作为切入点,通过临床调查和体外细胞培养,探讨VA对儿童抗病毒免疫力的影响及其分子机制,进一步证实VA营养在维护儿童免疫功能中的重要作用。第一部分维生素A营养对手足口病患儿抗病毒免疫力的影响目的通过分析HFMD患儿VA营养状态与血清干扰素-α(interferon-α, IFN-α)及EV71-IgM抗体水平的相关性,探讨VA营养对儿童抗病毒免疫力的影响。方法选取2010年10月至2011年6月我院传染科收治的450例手足口病患儿为研究对象,诊断标准参照卫生部发布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》；同时选取与患儿年龄和性别一致的113例非感染儿童作为对照组。1.采用荧光定量PCR法检测粪便样本中肠道病毒EV71；2.采用高效液相色谱法测定血清VA水平；3.采用24小时饮食回顾法调查膳食VA摄入水平,并结合临床病情进行分析；4. ELISA法测定血清IFN-α及EV71-IgM抗体水平。结果1.450例患儿中,男性303例(67.3%),女性147例(32.7%),平均年龄2.5岁,其中226例(50.2%)粪便EV71检测呈阳性,170例(37.8%)发生不同程度的并发症。2.总体血清VA水平为0.73±0.26μmol/L;其中237例(52.7%)血清VA浓度低于正常水平(0.7μmol/L).EV71阳性的患儿血清VA浓度(0.64±0.24μmol/L)低于EV71阴性患儿(O.825±0.25μmol/L),P<0.01.发生并发症的患儿血清VA浓度(0.66±0.23μmol/L)低于未发生并发症的患儿(0.78±0.27μmol/L),P<0.01.3.92%的患儿每日膳食VA摄入量低于推荐摄入量,其中1,-4岁年龄组患儿膳食VA摄入不足情况最严重(297.1±126.1μg视黄醇当量/天),仅为推荐摄入量的59.4%。4.与非感染对照组相比,患儿的血清IFN-α浓度显著升高,且VA正常组患儿血清FN-α,浓度(112.28(78.38～155.5)pg/mL)显著高于VA缺乏组患儿(57.29(39.92～85.4)pg/mL),P<0.01.发生并发症组患儿的血清IFN-α (67.13(46.57～109)pg/mL)浓度低于未发生并发症组(87.7(52.28～130.65)pg/mL),P<0.01.值得注意的是：相关分析结果显示：HFMD患儿血清VA水平与IFN-α浓度呈正性相关关系(相关系数为0.58,P<0.01)。5.VA正常组患儿血清EV71-IgM抗体浓度(32.9±11.8ng/mL)显著高于VA缺乏组(28.1±9.4ng/m),P<0.01.HFMD患儿血清VA水平与EV71-IgM抗体浓度呈正性相关(相关系数为0.41,P<0.01)。6.VA缺乏组的患儿并发症的发生率(45.99%)显著高于VA正常组(28.64%),P<0.01。结论1.HFMD患儿普遍存在膳食VA摄入不足；2.HFMD患儿中VA缺乏症的发生率增高,血清VA总体水平降低；3.伴有VA缺乏症的HFMD患儿中,血清IFN-α和EV71-IgM的浓度降低,且与血清VA水平的降低呈正性相关关系；4.在VA缺乏的MD患儿中并发症的发生率增高；5.VA营养不足可能导致了儿童抗HFMD的免疫力降低。第二部分视黄酸抑制EV71病毒感染的体外研究目的通过体外细胞培养,证实VA的体内活性代谢产物—全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,atRA)抗EV71病毒感染的作用及其途径。方法体外培养人单核细胞系U937细胞,分为8组：1.对照组：无atRA干预,无EV71感染；2.atRA组：给予atRA干预；3.Ro组：加入视黄酸受体β(retinoic acid receptor-α,RAR-α)特异性拮抗剂(Ro41-5253,Ro);4.atRA+Ro组：同时加入atRA和Ro;5.EV71组：给予EV71感染；6.EV71+atRA组：EV71感染细胞后加入atRA;7. EV71+Ro组：EV71感染细胞后加入Ro;8. EV71+atRA+Ro组：EV71感染细胞后同时加入atRA和Ro进行干预。分别于干预后24、48小时进行以下检测：1.免疫荧光染色法检测EV71抗原的表达；2.流式细胞计数法检测EV71感染细胞的百分率；3.流式细胞计数法检测EV71诱导的细胞凋亡率；4. ELISA检测细胞培养上清中IFN-a水平；4.荧光定量PCR法检测RAR-a, IFNA1和IFN受体IFNAR1mRNA的表达。结果1.EV71可感染体外培养的人单核细胞并诱导细胞凋亡。干预后48小时,与EV71组(45.22±3.68%)相比,EV71+atRA组细胞EV71感染率(26.52±4.33%)显著降低,P<0.01。此外,干预后24小时,EV71+atRA组细胞凋亡率(11.31±1.73%)也低于EV71组(17.64±1.12%),P<0.01；2.EV71感染后24小时,atRA干预可上调IFNA1与IFNAR1mRNA表达；且这种作用在EV71与atRA共同作用时更加显著。感染后48小时,atRA干预使IFN-α的蛋白水平显著升高。3.干预后24小时,atRA上调RAR-α mRNA的表达。与atRA单独作用相比,EV71+atRA组RAR-α mRNA的表达更高；而单独的EV71感染对RAR-α mRNA的表达无明显影响。4.当Ro同时加入时,atRA的上述作用均被阻抑。结论1. atRA能降低EV71对体外培养U937细胞的感染率,减少EV71感染造成的细胞凋亡,具有体外抑制EV71病毒的作用；2. atRA可上调EV71感染细胞IFN-a mRNA和蛋白的表达；3. atRA体外抑制EV71病毒的作用主要是通过RAR-a介导的。第三部分视黄酸对EV71诱导的免疫应答RIG-I通路的调节作用目的研究atRA对抗EV71病毒免疫应答视黄酸诱导基因-I(retinoic acid induced gene-I, RIG-I)通路的影响,探讨atRA发挥抗病毒作用的分子机制,为更深入的临床研究提供理论和实验依据。方法分离EV71感染患儿与非感染对照儿童的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。体外培养人单核细胞系U937细胞,给予EV71和/或atRA干预。分别抽提这两种细胞的RNA,采用PCR array的方法,检测与抗病毒免疫相关的84个主要基因的表达。结果通过对EV71感染的HFMD患儿PBMC的检测,我们发现,与非感染对照组相比,EV71感染组有50个基因的表达变化超过了2倍,其中27个基因表达上调,23个表达下调。EV71感染可下调RIG-I抗病毒通路中病毒识别受体RIG-I,接头蛋白IPS-1,效应基因TRAF3、RAF6,下游信号传导及靶基因TBK1、IRF3、IFNA1、IFNARl的表达；而体外细胞培养模型的检测结果显示：对EV71感染的U937细胞进行atRA干预,可上调这些基因的表达。结论EV71感染可影响抗病毒免疫应答RIG-I通路,而atRA对EV71体外细胞感染所诱导的RIG-I信号通路的变化具有调节作用,可能是其抗EV71病毒感染作用的分子机制。