百草枯(paraquat，PQ)是一种全球广泛使用的高效能除草剂。其对人体具有很强的毒性，经消化道、皮肤、呼吸道及静脉等吸收均可造成中毒，临床上缺乏有效的治疗措施，患者死亡率高达40-80％。我国PQ的生产和用量均居全球首位，近年国内PQ中毒发病呈倍数增长，防治形势非常严峻。　　PQ中毒可致全身多个脏器损伤，其中肺是受累最严重的靶器官，可出现“百草枯肺”，即早期表现为急性肺损伤，而后期则进展为肺间质纤维化，是PQ中毒患者死亡的主要原因。PQ在肺组织的主动摄取和蓄积被认为是其诱导肺损伤的重要原因。有证据表明PQ在肺组织的浓聚蓄积主要依赖于多胺转运系统，但迄今人们尚未成功分离哺乳动物的多胺转运体。尽管近来一些研究证实膜转运蛋白如有机阳离子转运蛋白(OCTs)、P糖蛋白(P-gp)及多重耐药相关蛋白(MRPs)等也与PQ的转运有关，然而PQ在肺组织细胞的跨膜转运的确切机制尚不清楚。　　近年，有研究通过对耐PQ的突变植株（牛筋草、拟南芥等）其耐药机制的分析，获得了PQ在植物内转运相关的重要信息，这为研究人体PQ跨膜转运机制提供了新思路。但迄今，尚未发现存在对PQ耐药的人体细胞可用于类似研究。　　本研究中，我们借鉴肿瘤学常用的构建耐药细胞模型的方法，首先，通过浓度递增、周期暴露PQ诱导人肺腺癌细胞(A549)，获得对PQ耐药的A549细胞(A549/PQ)，并观察了其生物学特性;其次，以基因芯片技术筛查了A549/PQ细胞与亲本细胞的差异表达基因，并结合文献筛选了5个表达明显上调的转运体基因作为候选基因;第三，通过RT-PCR和Western blot对5个候选基因进行表达的验证，并考察这些基因表达与PQ急性暴露的关系，最后确认一个基因SynaptotagminⅠ(SYT1)可能与A549/PQ细胞耐药有关;第四，以shRNA技术抑制A549/PQ细胞SYT1的表达，观察SYT1沉默对A549/PQ细胞生物学特性及细胞内PQ浓度的影响，初步确认SYT1基因在A549/PQ细胞形成耐药中的作用与机制。　　结果发现，与亲本细胞比，A549/PQ细胞体积增大、形态不规则、细胞间隙小;细胞的倍增时间明显延长;细胞周期分析表明耐药组G0/G1期细胞明显增多，而S期细胞明显减少;CCK-8检测表明PQ暴露后A549/PQ存活率明显高于亲本细胞，其对PQ的耐药指数7.98，为中度耐药;LDH释放实验也证实PQ诱导的A549/PQ细胞损伤明显轻于亲本细胞;流式细胞检测表明PQ诱导的A549/PQ细胞早期凋亡率低于亲本细胞;HPLC法测得暴露后A549/PQ细胞内PQ浓度明显低于亲本细胞。表明A549/PQ细胞与亲本细胞间存在明显的生物学差异，且细胞内浓度降低预示耐药细胞可能存在拮抗PQ蓄积的机制。　　基因芯片技术筛查表明，A549/PQ细胞与亲本细胞间共有3335个差异表达基因，其中显著上调的1555个，显著下调的有1780个。功能涉及转运体、胞内蛋白代谢与修饰、信号转导、受体结合、酶活性调节、细胞支架蛋白与结合等。其中，两组间存在126个差异表达的转运体基因（51个上调，75个下调），结合文献分析，表达上调最明显的5个基因包括DNM1，STEAP2, CDH1，SLC7A2, SYT1等可能参与A549/PQ耐药的形成机制。　　RT-PCR验证显示A549/PQ细胞上述5个候选基因表达均明显增强，与芯片结果一致。但给予800μmol/L的PQ暴露，不管是A549/PQ细胞还是亲本细胞，其DNM1、STEAP2、CDH1、SLC7A2 mRNA表达均未能随着PQ的暴露上调。而两组细胞内SYT1mRNA的表达在PQ急性暴露后均出现明显升高，提示SYT1可能参与了PQ诱导的细胞应激过程，并在A549/PQ细胞形成耐药中发挥重要作用。　　利用shRNA技术沉默A549/PQ的SYT1基因，并予PQ暴露，结果干扰后的A549/PQ细胞存活率较前明显下降， LDH释放明显增加，流式细胞技术及凋亡蛋白Bax/Bcl-2检测均提示早期凋亡较前明显增加，光镜下观察发现干扰后细胞在PQ暴露后皱缩明显，胞体颜色加深，显示损伤更明显。此外， HPLC法测得干扰后细胞内PQ浓度较前显著升高，且明显高于亲本细胞。进一步观察到PQ暴露可使A549/PQ及亲本细胞囊泡转运相关蛋白SYT1、SNAP25、Rab26表达明显上调，提示PQ暴露可使两组细胞囊泡转运加强;而SYT1基因沉默可明显抑制A549/PQ细胞内上述囊泡转运相关蛋白的表达，抑制囊泡转运。表明，SYT1基因沉默可完全逆转A549/PQ细胞对PQ的耐药性，且细胞内囊泡转运被抑制，伴随胞内PQ蓄积增加。　　根据以上研究结果，我们得出如下结论:　　1、成功构建了对PQ耐药的A549细胞(A549/PQ)，其生物学特征与亲本细胞存在明显差异。暴露后A549/PQ细胞内PQ浓度明显低于亲本细胞，提示A549/PQ细胞内存在拮抗PQ蓄积的机制。这为PQ毒理及其跨膜转运机制研究提供了良好的细胞模型。　　2、A459/PQ细胞与亲本细胞的基因表达存在明显差异，差异表达基因功能涉及转运体、胞内蛋白代谢与修饰、信号转导、受体结合、酶活性调节、细胞支架蛋白与结合等，提示A549/PQ细胞对PQ耐药是一个多基因参与的复杂过程。　　3、A549/PQ细胞与亲本细胞转运体基因表达存在明显差异。经验证SYT1在亲本细胞低表达，而在A549/PQ细胞呈高表达，且两组细胞SYT1表达在PQ急性暴露后均可进一步升高，提示SYT1可能参与PQ诱导的细胞应激代偿过程，并在A549/PQ细胞拮抗PQ毒性形成耐药中发挥重要作用。　　4、成功构建含SYT1-RNAi的慢病毒载体，实现对A549/PQ细胞目的基因及蛋白表达的下调，且SYT1基因沉默对A549/PQ细胞无明显毒性作用。　　5、SYT1基因沉默可完全消除A549/PQ细胞对PQ的耐药性，且其对PQ毒性的敏感性更高于亲本细胞，表明SYT1在A549/PQ细胞拮抗PQ毒性形成耐药作用中起着至关重要的作用。　　6、SYT1基因沉默明显抑制A549/PQ细胞内囊泡转运，细胞内PQ浓度因此而升高，提示SYT1调控的囊泡转运可能参与了A549/PQ细胞PQ排出的过程。　　7、基因芯片技术是一种高效、准确、高通量的研究方法，可用于A549/PQ细胞拮抗PQ毒性形成耐药的机制研究。